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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 关于RNAi干扰的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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yushijiang30

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于RNAi干扰的问题 已有3人参与

我做真菌的干扰，我构建好的干扰片段：正向+intron+反向片段能不能插入到一个开放阅读框的下游，比如启动子——抗潮霉素基因——终止子，我能不能把片段插入到抗潮霉素基因——终止子 之间呢，还是只能放在启动子后面？

[ Last edited by silicare on 2014-3-3 at 08:42 ]
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1楼 2014-02-21 11:38:12
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意孤城_

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-30 16:22:26
我不明白一点，你要干扰的基因是真菌自身表达的还是？如果是自身表达为何又要转抗潮霉素基因？双重抑制？
表达siRNA或者shRNA的载体是个单独的，因为表达RNA的启动子一般和表达DNA的启动子是不一样的
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3楼2014-02-22 15:17:34
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
插入在潮霉素基因后端好些，我们RNAi都是单独一个表达盒驱动，你这样会影响潮霉素表达。
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hehe
4楼2014-02-22 19:53:10
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
放在后面会不会和潮霉素一起翻译成融合蛋白啊？起不到干扰作用，放在前面会不会干扰潮霉素的翻译，不能筛选阳性转化子？感觉还是两套单独的转录系统比较靠谱吧。

[ 发自小木虫客户端 ]
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姥姥不疼，舅舅不爱
10楼2014-02-24 15:43:09
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普通回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个应该在前面吧。如果放在后面的话，在未表达基因之前，RNAi片段都已经断开了。我是这么认为的，不知道是不是这样。

还有，我现在做的克隆是分别的，按你的意思就是说1.启动子——抗潮霉素基因——终止子，2.启动子——正向+intron+反向片段——终止子。是两个载体，这是做植物的。
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2楼2014-02-21 15:05:38
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yushijiang30

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 意孤城_ at 2014-02-22 15:17:34
我不明白一点，你要干扰的基因是真菌自身表达的还是？如果是自身表达为何又要转抗潮霉素基因？双重抑制？
表达siRNA或者shRNA的载体是个单独的，因为表达RNA的启动子一般和表达DNA的启动子是不一样的

我做的是通过真菌介导干扰害虫，把干扰载体转入真菌，在真菌入侵昆虫的时候释放干扰片段到昆虫体内。抗潮霉素基因是用来筛选阳性真菌的，你说的RNAi干扰的启动子不一样，我的启动子是真菌的色氨酸启动子，启动500bp左右的干扰片段，这样行吗
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5楼2014-02-24 10:03:34
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yushijiang30

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-02-22 19:53:10
插入在潮霉素基因后端好些，我们RNAi都是单独一个表达盒驱动，你这样会影响潮霉素表达。

我也是图省事，要是有适合的酶切位点，我打算插入到潮霉素基因下游，这样就不用重新连接启动子，终止子基因进去了，所以才问问我这样做行不行，如果不行，就只好重新构建一个表达盒了。

另问，干扰片段和超表达片段毕竟不一样，像超表达是要表达成蛋白质的，最好有单独的启动子启动，真核生物毕竟是单顺反子的，但是干扰载体不一样，他只要在转录结束后，正反片段互补形成颈环结构就行了，连在任何一个表达基因后边都不会对前边的基因表达形成阻碍，我这样理解正确吗？
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6楼2014-02-24 10:13:41
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yushijiang30 at 2014-02-24 10:13:41
我也是图省事，要是有适合的酶切位点，我打算插入到潮霉素基因下游，这样就不用重新连接启动子，终止子基因进去了，所以才问问我这样做行不行，如果不行，就只好重新构建一个表达盒了。

另问，干扰片段和超表达 ...

是的
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hehe
7楼2014-02-24 12:04:36
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意孤城_

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yushijiang30 at 2014-02-24 10:03:34
我做的是通过真菌介导干扰害虫，把干扰载体转入真菌，在真菌入侵昆虫的时候释放干扰片段到昆虫体内。抗潮霉素基因是用来筛选阳性真菌的，你说的RNAi干扰的启动子不一样，我的启动子是真菌的色氨酸启动子，启动500b ...

可以的，他们两个基因具有不同的表达盒，你的抗性基因和干扰基因要在两个不同的表达盒内，是2个阅读框。一个可以完整表达抗性基因，一个完整表达干扰基因，可以在一个载体上实现
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8楼2014-02-24 12:19:27
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yushijiang30

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 意孤城_ at 2014-02-24 12:19:27
可以的，他们两个基因具有不同的表达盒，你的抗性基因和干扰基因要在两个不同的表达盒内，是2个阅读框。一个可以完整表达抗性基因，一个完整表达干扰基因，可以在一个载体上实现...

好的，已经明白了。
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9楼2014-02-24 15:22:49
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