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梦过留声

金虫 (小有名气)

[求助] 请教高手:金属层析法分离蛋白是否会造成蛋白变性? 已有3人参与

最近在看金属层析法分离蛋白方面的文献,大多数文献利用Cu、Ni等金属离子与甘氨酸等氨基酸的特异性结合来实现蛋白质的分离,我不太清楚金属离子与蛋白结合后会否导致蛋白变性?蛋白质变性是由于空间结构发生变化,照这么看层析过程中,金属离子仅仅与蛋白质残留的氨基酸结合,是不是可以理解为没有破坏蛋白的结构?还是说层析过程造成蛋白活性降低,但是蛋白分离后将金属离子洗脱后,蛋白会复性? 跪求大侠解答,万分感谢!
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加油!
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梦过留声

金虫 (小有名气)

坛子里这么多做蛋白纯化的高手都去哪了呢?
加油!
2楼2014-01-16 15:02:51
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.首先,金属离子螯合层析不会导致蛋白质变性。因为特异性结合的是蛋白质标签。
2.如果你纯化过程中的缓冲液条件摸索不好,蛋白质会变性,这个变性是可逆的。
3楼2014-01-17 15:24:01
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梦过留声

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-01-17 15:24:01
1.首先,金属离子螯合层析不会导致蛋白质变性。因为特异性结合的是蛋白质标签。
2.如果你纯化过程中的缓冲液条件摸索不好,蛋白质会变性,这个变性是可逆的。

什么叫蛋白质标签?我是新手,求指导?还有,如果用金属离子螯合层析分离蛋白酶,分离后能保持酶的活性吗?
加油!
4楼2014-01-17 18:35:50
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toplxb

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我过去就做镍柱亲和层析纯化蛋白,温度一定要保持在4°,ph要略碱性,当时我做实验的时候是ph为8。不会变性,没有问题。
5楼2014-01-24 11:46:20
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1.蛋白质标签就是所谓的能和金属离子特异性结合的氨基酸,一般基因工程蛋白都会让目的蛋白连一个HIS的,现在就是所谓的HIS-tag。
2.如果要保持酶活性,需要掌握缓冲液的条件,尽量用温和的pH和离子条件进行纯化。
6楼2014-01-24 15:59:58
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treetreew

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

亲和层析本身是不太会
倒是6个his容易被包住

变形靠rp,缓冲体系不合适,太容易变性了,前后经历好多缓冲体系,
至于变性了是不是可逆,理论上有一些是可逆的,但我看基本希望不大。
7楼2014-01-26 09:46:02
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