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sr_913

金虫 (初入文坛)

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[求助] 质粒构建出了奇怪的现象，实在找不到原因，请大家帮忙看看已有2人参与

大家好！
      我现在在做Plk0.1-EGF载体重组质粒的构建。有几个问题始终解决不了，找不到原因。
      我是载体和目的基因（大小80bp）用EcoRI 和AgeI 37℃过夜双酶切后，跑电泳，胶回收，然后用T4连接。连接产物转化Stbl3感受态. 做了连接的负对照，负对照长了四五个菌落，连接产物大概长十几个菌落，但挑菌抽质粒跑胶后，发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）。这是什么原因呢？操作什么的应该都没有问题。另外，我们目前用的这个载体是前人改造过的，EcoRI 和AgeI酶切位点之间只有几十bp大小的序列。
      我看到  shRNA载体质粒plko.1 mannual，上面说用EcoR I 和Age I分别酶切。并且Age I是先切的，这是为什么，一定要按这顺序切吗？不可以一起双切吗？

[ Last edited by sr_913 on 2014-1-14 at 12:54 ]

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1楼 2014-01-13 16:12:23

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sr_913

金虫 (初入文坛)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by gongeleven at 2014-01-14 15:47:41
发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）：环状质粒电泳的时候大小比线性的偏小。
可以双切吧，可能以前的AgeI和EcoRI酶没有共用buffer，所以分开切了
建议去测序，一切以测序结果为准。

跑的空载也是抽质粒抽出来的，没有切过，应该也是环状的吧。昨天把抽出来的重组质粒做了AgeI和EcoRI的双酶切，跑出来是两条带，但是大小不对，一条在5k，一条在3k，很奇怪。老板说这种情况对的概率很小，不愿意花钱测序，哎~