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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建出了奇怪的现象，实在找不到原因，请大家帮忙看看
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sr_913

金虫 (初入文坛)

[求助] 质粒构建出了奇怪的现象，实在找不到原因，请大家帮忙看看 已有2人参与

大家好！
        我现在在做Plk0.1-EGF载体重组质粒的构建。有几个问题始终解决不了，找不到原因。
        我是载体和目的基因（大小80bp）用EcoRI 和AgeI 37℃过夜双酶切后，跑电泳，胶回收，然后用T4连接。连接产物转化Stbl3感受态. 做了连接的负对照，负对照长了四五个菌落，连接产物大概长十几个菌落，但挑菌抽质粒跑胶后，发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）。这是什么原因呢？操作什么的应该都没有问题。另外，我们目前用的这个载体是前人改造过的，EcoRI 和AgeI酶切位点之间只有几十bp大小的序列。
        我看到  shRNA载体质粒plko.1 mannual，上面说用EcoR I 和Age I分别酶切。并且Age I是先切的，这是为什么，一定要按这顺序切吗？不可以一起双切吗？

[ Last edited by sr_913 on 2014-1-14 at 12:54 ]
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1楼 2014-01-13 16:12:23
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sr_913: 金币+3, ★有帮助, 谢谢这位虫友，希望得到进一步解答 2014-01-14 16:50:40
sr_913(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-01-15 08:33:48
发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）：环状质粒电泳的时候大小比线性的偏小。
可以双切吧，可能以前的AgeI和EcoRI酶没有共用buffer，所以分开切了
建议去测序，一切以测序结果为准。
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3楼2014-01-14 15:47:41
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sr_913: 金币+2, ★有帮助 2014-01-15 13:21:47
可以双酶切的，其中没有特异结构可以用的。
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hehe
5楼2014-01-14 16:50:25
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
sr_913(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-01-15 08:33:54
sr_913: 金币+2, ★有帮助 2014-01-15 13:24:27
你跑一个菌落PCR确定你转入目的片段了没有。确定你的质粒是不是你所需要的。再做酶切验证。
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hehe
6楼2014-01-14 16:57:54
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sr_913 at 2014-01-14 16:46:53
跑的空载也是抽质粒抽出来的，没有切过，应该也是环状的吧。昨天把抽出来的重组质粒做了AgeI和EcoRI的双酶切，跑出来是两条带，但是大小不对，一条在5k，一条在3k，很奇怪。老板说这种情况对的概率很小，不愿意花钱 ...

几个测序反应也就几十块钱，老板这么不愿意测序，说明前人也基本不测序，让人怀疑前人做的这个载体是不是有问题。
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7楼2014-01-15 08:49:25
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j2

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sr_913 at 2014-01-14 16:46:53
跑的空载也是抽质粒抽出来的，没有切过，应该也是环状的吧。昨天把抽出来的重组质粒做了AgeI和EcoRI的双酶切，跑出来是两条带，但是大小不对，一条在5k，一条在3k，很奇怪。老板说这种情况对的概率很小，不愿意花钱 ...

确定载体没问题？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
8楼2014-01-15 08:59:50
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普通回帖

sr_913

金虫 (初入文坛)
大家帮帮忙呀，狠着急狠着急~~
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2楼2014-01-14 13:07:46
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sr_913

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gongeleven at 2014-01-14 15:47:41
发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）：环状质粒电泳的时候大小比线性的偏小。
可以双切吧，可能以前的AgeI和EcoRI酶没有共用buffer，所以分开切了
建议去测序，一切以测序结果为准。

跑的空载也是抽质粒抽出来的，没有切过，应该也是环状的吧。昨天把抽出来的重组质粒做了AgeI和EcoRI的双酶切，跑出来是两条带，但是大小不对，一条在5k，一条在3k，很奇怪。老板说这种情况对的概率很小，不愿意花钱测序，哎~
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4楼2014-01-14 16:46:53
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sr_913

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-14 16:57:54
你跑一个菌落PCR确定你转入目的片段了没有。确定你的质粒是不是你所需要的。再做酶切验证。

目的片段太小，只有80bp，跑出来分不清是目的片段还是引物二聚体
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9楼2014-01-15 13:19:15
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sr_913

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-14 16:50:25
可以双酶切的，其中没有特异结构可以用的。

谢谢！
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10楼2014-01-15 13:21:56
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