应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建出了奇怪的现象，实在找不到原因，请大家帮忙看看
51/1返回列表
查看: 3051  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

sr_913

金虫 (初入文坛)

[求助] 质粒构建出了奇怪的现象，实在找不到原因，请大家帮忙看看 已有2人参与

大家好！
        我现在在做Plk0.1-EGF载体重组质粒的构建。有几个问题始终解决不了，找不到原因。
        我是载体和目的基因（大小80bp）用EcoRI 和AgeI 37℃过夜双酶切后，跑电泳，胶回收，然后用T4连接。连接产物转化Stbl3感受态. 做了连接的负对照，负对照长了四五个菌落，连接产物大概长十几个菌落，但挑菌抽质粒跑胶后，发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）。这是什么原因呢？操作什么的应该都没有问题。另外，我们目前用的这个载体是前人改造过的，EcoRI 和AgeI酶切位点之间只有几十bp大小的序列。
        我看到  shRNA载体质粒plko.1 mannual，上面说用EcoR I 和Age I分别酶切。并且Age I是先切的，这是为什么，一定要按这顺序切吗？不可以一起双切吗？

[ Last edited by sr_913 on 2014-1-14 at 12:54 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-01-13 16:12:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
sr_913(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-01-15 08:33:54
sr_913: 金币+2, ★有帮助 2014-01-15 13:24:27
你跑一个菌落PCR确定你转入目的片段了没有。确定你的质粒是不是你所需要的。再做酶切验证。
赞一下(1人) 回复此楼
hehe
6楼2014-01-14 16:57:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

sr_913

金虫 (初入文坛)
大家帮帮忙呀，狠着急狠着急~~
赞一下 回复此楼
2楼2014-01-14 13:07:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sr_913: 金币+3, ★有帮助, 谢谢这位虫友，希望得到进一步解答 2014-01-14 16:50:40
sr_913(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2014-01-15 08:33:48
发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）：环状质粒电泳的时候大小比线性的偏小。
可以双切吧，可能以前的AgeI和EcoRI酶没有共用buffer，所以分开切了
建议去测序，一切以测序结果为准。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-01-14 15:47:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sr_913

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gongeleven at 2014-01-14 15:47:41
发现抽出来的质粒比空载体小很多（估计2K左右）：环状质粒电泳的时候大小比线性的偏小。
可以双切吧，可能以前的AgeI和EcoRI酶没有共用buffer，所以分开切了
建议去测序，一切以测序结果为准。

跑的空载也是抽质粒抽出来的，没有切过，应该也是环状的吧。昨天把抽出来的重组质粒做了AgeI和EcoRI的双酶切，跑出来是两条带，但是大小不对，一条在5k，一条在3k，很奇怪。老板说这种情况对的概率很小，不愿意花钱测序，哎~
赞一下 回复此楼
4楼2014-01-14 16:46:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0703化学调剂 ，六级已过，有科研经历 +12 曦熙兮 2026-03-15 12/600 2026-03-19 19:42 by maocaozhuxi
[考研] 307求调剂 +8 冷笙123 2026-03-17 8/400 2026-03-19 19:38 by maocaozhuxi
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +9 一鸭鸭哟 2026-03-14 11/550 2026-03-19 17:22 by ！本暗一次！
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +17 不知道叫什么！ 2026-03-15 19/950 2026-03-19 15:06 by 尽舜尧1
[考研] 一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂 +5 枫桥ZL 2026-03-18 7/350 2026-03-19 14:52 by 功夫疯狂
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-18 3/150 2026-03-19 14:42 by peike
[考研] 346求调剂[0856] +3 WayneLim327 2026-03-16 6/300 2026-03-19 11:21 by WayneLim327
[考研] 0703化学调剂 +8 妮妮ninicgb 2026-03-15 12/600 2026-03-19 05:55 by anny19840123
[考研] 085410人工智能专硕317求调剂（0854都可以） +3 xbxudjdn 2026-03-18 3/150 2026-03-18 22:14 by zhq0425
[考研] 材料专业求调剂 +5 hanamiko 2026-03-18 5/250 2026-03-18 20:19 by 星空星月
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +8 Ncdx123456 2026-03-13 9/450 2026-03-18 14:40 by haxia
[考研] 302求调剂 +10 呼呼呼。。。。 2026-03-17 10/500 2026-03-18 12:45 by Linda Hu
[考研] 环境工程调剂 +8 大可digkids 2026-03-16 8/400 2026-03-18 09:36 by zhukairuo
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +4 张vvvv 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:15 by ruiyingmiao
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 304求调剂 +3 曼殊2266 2026-03-14 3/150 2026-03-16 16:39 by houyaoxu
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 一志愿华中师范071000，325求调剂 +6 RuitingC 2026-03-12 6/300 2026-03-16 14:50 by 可淡不可忘
[考研] 0703化学调剂 290分有科研经历，论文在投 +7 腻腻gk 2026-03-14 7/350 2026-03-16 10:12 by houyaoxu
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭