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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 同源重组双交换 自杀质粒pMKS1
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free-fish

铜虫 (正式写手)

[求助] 同源重组双交换 自杀质粒pMKS1 已有2人参与

用自杀质粒pMKS1对目的基因进行敲除，目的基因大小约15oobp，构建上下游同源臂分别为600多和500多，电转后得到了一些在抗生素上能长的目的菌，但是经过或者不经过松弛培养的目的菌转到蔗糖筛选培养基后就让人很纠结，因为单克隆实在是太多，表型跟野生型也无法区分，每天挑100多个克隆PCR验证都没得到缺失突变体，挑了一周了，请问，我继续挑单克隆还有意义么？在蔗糖这个选择压下，发生双交换的概率到底有多大？
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1楼 2014-01-05 20:43:21
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ccf821020

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by free-fish at 2014-01-06 10:29:40
你好，请问电转后，携带重组突变同源臂的自杀载体能独立存在于宿主细胞内么？在抗生素上能长的单克隆总是P出比野生型缺失了目的片段长度的条带，而在蔗糖上筛选过的单克隆则与野生型一样的条带...

你好，问题解决了吗？我现在也遇到问题了，我用的是自杀质粒，单交换获得了，但是双交换死活弄不出。传了10代挑了800多株，只有1株是敏感型，经过验证是回复成了野生型的菌株。双交换敲除菌株这么难敲除吗？
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5楼2017-09-01 09:45:06
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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free-fish: 金币+5 2014-01-06 10:26:12
我建议你再筛选个一个周期，
如果还没有的话，考虑放弃比较好
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2楼2014-01-06 07:41:14
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free-fish

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2014-01-06 07:41:14
我建议你再筛选个一个周期，
如果还没有的话，考虑放弃比较好

你好，请问电转后，携带重组突变同源臂的自杀载体能独立存在于宿主细胞内么？在抗生素上能长的单克隆总是P出比野生型缺失了目的片段长度的条带，而在蔗糖上筛选过的单克隆则与野生型一样的条带
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3楼2014-01-06 10:29:40
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ccf821020

新虫 (小有名气)
你好，问题解决了吗？我现在也遇到问题了，我用的是自杀质粒，单交换获得了，但是双交换死活弄不出。传了10代挑了800多株，只有1株是敏感型，经过验证是回复成了野生型的菌株。双交换敲除菌株这么难敲除吗？
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4楼2017-09-01 09:44:56
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