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w_goodluck铜虫 (小有名气)
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[求助]
革兰氏阳性细菌-枯草芽胞杆菌 total RNA提取-问题求助 已有1人参与
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大家好，先说下我是RNA方面新手，接触时间不长，在实验室中遇到了问题，请求大家帮助。 先简单说下实验方案：研究对象是枯草芽胞杆菌，培养条件是41度，LB+20g/L葡萄糖，240rpm，当OD=0.9-1.1之间时，采用invitrogen TRIzol Max Bacterial RNA Isolation Kit（附件为使用说明书）来提取4株不同基因型的枯草芽胞杆菌的total RNA，菌液量为1ml或1.5ml。total RNA是准备用来进行RNA-SEQ测序(illumia Hiseq2000平台），做基因差异表达分析的。 问1：该试剂盒其实只包括两种试剂，一种为Max Bacterial Enhancement Reagent，另一种为 TRlzol@ Reagent。该试剂盒有人用过么？第一种试剂Max Bacterial Enhancement Reagent除了破壁之外还有什么作用么？比如可以固定RNA防止被降解？ 问2：经过几次实验发现Max Bacterial Enhancement Reagent试剂是失效的。这是因为用Max Bacterial Enhancement Reagent提取没有提取到RNA。但是采用100微升 TE(pH8.0)溶解的3 mg/ml溶菌酶，37度，处理8分钟后，提取到了RNA。说明trizol是可用的。但是带来一个担心：在溶菌酶处理过程中，RNA有没有可能发生部分降解？（毕竟没有RNA保护剂之类存在）对于获得的total RNA用来RNA-SEQ时，是不是会丢失一些低丰度的信息？另外一个困扰：采用溶菌酶处理后，电泳为三条条带，BD2000测定RNA质量尚可（260/280=2左右），但是浓度好低，1ml菌液仅提取了大概200 ng/ul的浓度(用40ul Rnase-free ddw溶解)，有人可以给出可能的原因么？是细胞破壁不完全么（实验室没有显微镜，没法镜检溶菌效果）？ 问3：该试剂盒提到每ml trizol对应的菌的数量不超过10的8次方，请问有人知道枯草芽胞杆菌在LB培养基下，OD为1时大概是多少菌的数量么？ 谢谢大家！ |
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2013-12-23 16:56:49, 174.61 K
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cicelyzh
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【答案】应助回帖
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1. 没用过你说的这个kit。TRIZOL的作用是裂解细胞的。Max Bacterial Enhancement Reagent很可能是核酸酶抑制剂，用于失活核酸酶，防止RNA降解的。你用了Max Bacterial Enhancement Reagent提不到RNA应该是细胞本身比较难破，普通的步骤下trizol不能很好的裂解细胞，也就是为什么你用溶菌酶处理后得到RNA的原因。你可以试试加TRIZOL后用65°C处理5-10min来代替室温。 2. 用溶菌酶处理时当然可能造成RNA的降解。加TRIZOL后因为体系里有酚，可以一定程度上避免RNA降解。一般RNA量少的原因都是破碎不完全。 3. TRIZOL试剂是有这个说明，不过你可以适当增加一点（10倍以内）。没有做过枯草芽胞杆菌，不清楚OD与细胞数对应的关系。 |
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