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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 革兰氏阳性细菌-枯草芽胞杆菌 total RNA提取-问题求助
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)

[求助] 革兰氏阳性细菌-枯草芽胞杆菌 total RNA提取-问题求助 已有1人参与

大家好，先说下我是RNA方面新手，接触时间不长，在实验室中遇到了问题，请求大家帮助。
先简单说下实验方案：研究对象是枯草芽胞杆菌，培养条件是41度，LB+20g/L葡萄糖，240rpm，当OD=0.9-1.1之间时，采用invitrogen TRIzol Max Bacterial RNA Isolation Kit（附件为使用说明书）来提取4株不同基因型的枯草芽胞杆菌的total RNA，菌液量为1ml或1.5ml。total RNA是准备用来进行RNA-SEQ测序(illumia Hiseq2000平台），做基因差异表达分析的。
问1：该试剂盒其实只包括两种试剂，一种为Max Bacterial Enhancement Reagent，另一种为 TRlzol@ Reagent。该试剂盒有人用过么？第一种试剂Max Bacterial Enhancement Reagent除了破壁之外还有什么作用么？比如可以固定RNA防止被降解？
问2：经过几次实验发现Max Bacterial Enhancement Reagent试剂是失效的。这是因为用Max Bacterial Enhancement Reagent提取没有提取到RNA。但是采用100微升 TE(pH8.0)溶解的3 mg/ml溶菌酶，37度，处理8分钟后，提取到了RNA。说明trizol是可用的。但是带来一个担心：在溶菌酶处理过程中，RNA有没有可能发生部分降解？（毕竟没有RNA保护剂之类存在）对于获得的total RNA用来RNA-SEQ时，是不是会丢失一些低丰度的信息？另外一个困扰：采用溶菌酶处理后，电泳为三条条带，BD2000测定RNA质量尚可（260/280=2左右），但是浓度好低，1ml菌液仅提取了大概200 ng/ul的浓度(用40ul Rnase-free ddw溶解)，有人可以给出可能的原因么？是细胞破壁不完全么（实验室没有显微镜，没法镜检溶菌效果）？
问3：该试剂盒提到每ml trizol对应的菌的数量不超过10的8次方，请问有人知道枯草芽胞杆菌在LB培养基下，OD为1时大概是多少菌的数量么？

谢谢大家！
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  • 附件 1 : TRIzol_Max_Bacterial_RNA_Isolation_Kit.pdf
    • 2013-12-23 16:56:49, 174.61 K

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1楼 2013-12-23 17:14:16
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)
w_goodluck: 回帖置顶 2013-12-29 22:10:25
引用回帖:
4楼: Originally posted by w_goodluck at 2013-12-24 11:05:29
普通的步骤下trizol不能很好的裂解细胞？ 但是我看到trizol的使用说明书上写到单独的使用trizol即可以应用处理于许多材料，比如人类、动物、植物或细菌来源的组织（50-100毫克）和细胞（5×106），以及大量的组织（ ...

没人么？难道我发错版了？顶啊

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5楼2013-12-25 07:24:05
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)
没人么？我顶~~
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2楼2013-12-23 17:52:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
w_goodluck: 回帖置顶 2013-12-29 22:10:36
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 21:24:20
1. 没用过你说的这个kit。TRIZOL的作用是裂解细胞的。Max Bacterial Enhancement Reagent很可能是核酸酶抑制剂，用于失活核酸酶，防止RNA降解的。你用了Max Bacterial Enhancement Reagent提不到RNA应该是细胞本身比较难破，普通的步骤下trizol不能很好的裂解细胞，也就是为什么你用溶菌酶处理后得到RNA的原因。你可以试试加TRIZOL后用65°C处理5-10min来代替室温。
2. 用溶菌酶处理时当然可能造成RNA的降解。加TRIZOL后因为体系里有酚，可以一定程度上避免RNA降解。一般RNA量少的原因都是破碎不完全。
3. TRIZOL试剂是有这个说明，不过你可以适当增加一点（10倍以内）。没有做过枯草芽胞杆菌，不清楚OD与细胞数对应的关系。
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3楼2013-12-24 09:13:55
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-24 09:13:55
1. 没用过你说的这个kit。TRIZOL的作用是裂解细胞的。Max Bacterial Enhancement Reagent很可能是核酸酶抑制剂，用于失活核酸酶，防止RNA降解的。你用了Max Bacterial Enhancement Reagent提不到RNA应该是细胞本身比 ...

普通的步骤下trizol不能很好的裂解细胞？ 但是我看到trizol的使用说明书上写到单独的使用trizol即可以应用处理于许多材料，比如人类、动物、植物或细菌来源的组织（50-100毫克）和细胞（5×106），以及大量的组织（≥1g）和细胞（>107）。我有个疑问，按照说明书推荐用量的trizol，能保证裂解所有的细胞么？还是说咱们提取的total RNA，只是从一部分裂解的细胞中得到的？
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4楼2013-12-24 11:05:29
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