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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 综合其他 » 磁珠标记、细胞捕获问题
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gniy

金虫 (初入文坛)

[求助] 磁珠标记、细胞捕获问题 已有1人参与

最近做纳米磁珠标记抗体捕获细胞，却发现未经抗体标记的磁珠也与细胞非特异吸附，请各位帮忙看看步骤上有什么问题？
磁珠是通过EDC/HNS方式活化，0.5mg/mg Beads，活化缓冲液10mM MES，pH5.5，室温振荡活化30min，洗脱后进行抗体偶联，25ug/mg Beads，偶联缓冲液10mM PBS，pH 7.4，4度过夜，之后磁分离,PBS洗，PBST+1%BSA封闭，但是没有经过羧基终止反应步骤，是不是可能有残余羧基与细胞表面蛋白产生结合导致假阳性的发生？谢谢。
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磁珠

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1楼 2013-12-18 12:26:58
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gniy

金虫 (初入文坛)
没有人做过类似的实验么
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2楼2013-12-18 15:07:01
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hxl19880503

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gniy: 金币+10, ★★★很有帮助, 我去试试看 2013-12-19 12:28:51
markar: 金币+2, 感谢回帖交流！ 2013-12-19 20:04:39
磁珠是通过EDC/HNS方式活化，0.5mg/mg Beads，活化缓冲液10mM MES，pH5.5，室温振荡活化30min，洗脱后进行抗体偶联，25ug/mg Beads，偶联缓冲液10mM PBS，pH 7.4，4度过夜，之后磁分离,PBS洗，PBST+1%BSA封闭，但是没有经过羧基终止反应步骤，是不是可能有残余羧基与细胞表面蛋白产生结合导致假阳性的发生？

以下是我们做标记的方法，看一下对你有没有用：
1. 活化方式为EDC/NHSS，活化60min，期间补加一次EDC呢；
2.偶联时PH值会调到8，偶联抗体我们只用2 h呢，不需要过夜的；
3.终浓度1%BSA封闭45 min，这基本上就可以避免非特异吸附呢.（BSA的浓度可以提高，实在不行的话就只能尝试其他的封闭剂呢，如乙醇胺，PEG胺等）；
4.没有听过羧基终止反应步骤呢，封闭就是将残留的羧基完全反应呢。
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蔡小蕾99
真情妙悟铸文章
3楼2013-12-19 08:55:45
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芳芳乐呵

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxl19880503 at 2013-12-19 08:55:45
磁珠是通过EDC/HNS方式活化，0.5mg/mg Beads，活化缓冲液10mM MES，pH5.5，室温振荡活化30min，洗脱后进行抗体偶联，25ug/mg Beads，偶联缓冲液10mM PBS，pH 7.4，4度过夜，之后磁分离,PBS洗，PBST+1%BSA封闭，但是 ...

楼主你们用来做分离的磁珠尺寸都大概多大啊
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4楼2014-05-27 17:12:17
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蔡小蕾99

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxl19880503 at 2013-12-19 08:55:45
磁珠是通过EDC/HNS方式活化，0.5mg/mg Beads，活化缓冲液10mM MES，pH5.5，室温振荡活化30min，洗脱后进行抗体偶联，25ug/mg Beads，偶联缓冲液10mM PBS，pH 7.4，4度过夜，之后磁分离,PBS洗，PBST+1%BSA封闭，但是 ...

Bsa封闭磁珠时是静置吗

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5楼2017-06-15 13:59:56
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蔡小蕾99

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 芳芳乐呵 at 2014-05-27 17:12:17
楼主你们用来做分离的磁珠尺寸都大概多大啊...

1微米

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6楼2017-06-15 14:00:38
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zld20180203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hxl19880503 at 2013-12-19 08:55:45
磁珠是通过EDC/HNS方式活化，0.5mg/mg Beads，活化缓冲液10mM MES，pH5.5，室温振荡活化30min，洗脱后进行抗体偶联，25ug/mg Beads，偶联缓冲液10mM PBS，pH 7.4，4度过夜，之后磁分离,PBS洗，PBST+1%BSA封闭，但是 ...

你好请问EDC和NHS得比例是多少？或者浓度？

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7楼2018-03-24 23:14:51
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