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磁珠标记、细胞捕获问题 已有1人参与
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最近做纳米磁珠标记抗体捕获细胞，却发现未经抗体标记的磁珠也与细胞非特异吸附，请各位帮忙看看步骤上有什么问题？ 磁珠是通过EDC/HNS方式活化，0.5mg/mg Beads，活化缓冲液10mM MES，pH5.5，室温振荡活化30min，洗脱后进行抗体偶联，25ug/mg Beads，偶联缓冲液10mM PBS，pH 7.4，4度过夜，之后磁分离,PBS洗，PBST+1%BSA封闭，但是没有经过羧基终止反应步骤，是不是可能有残余羧基与细胞表面蛋白产生结合导致假阳性的发生？谢谢。 |
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 磁珠 |
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2楼2013-12-18 15:07:01
hxl19880503
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磁珠是通过EDC/HNS方式活化，0.5mg/mg Beads，活化缓冲液10mM MES，pH5.5，室温振荡活化30min，洗脱后进行抗体偶联，25ug/mg Beads，偶联缓冲液10mM PBS，pH 7.4，4度过夜，之后磁分离,PBS洗，PBST+1%BSA封闭，但是没有经过羧基终止反应步骤，是不是可能有残余羧基与细胞表面蛋白产生结合导致假阳性的发生？ 以下是我们做标记的方法，看一下对你有没有用： 1. 活化方式为EDC/NHSS，活化60min，期间补加一次EDC呢； 2.偶联时PH值会调到8，偶联抗体我们只用2 h呢，不需要过夜的； 3.终浓度1%BSA封闭45 min，这基本上就可以避免非特异吸附呢.（BSA的浓度可以提高，实在不行的话就只能尝试其他的封闭剂呢，如乙醇胺，PEG胺等）； 4.没有听过羧基终止反应步骤呢，封闭就是将残留的羧基完全反应呢。 |
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蔡小蕾99
3楼2013-12-19 08:55:45
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