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kyll223082

金虫 (小有名气)

[交流] 蛋白胶内消化及质谱分析问题

本人最近在做蛋白组学，用的样本是小鼠血浆，在前期已经用垂直电泳进行了分离，二相电泳也做了，到了消化一步，看了很多论坛和技术支持，但是就是没有找到消化后进行初步鉴定是不是把蛋白质从凝胶中消化下来了，不想直接拿着去上质谱。有没有谁做过的，给点建议。

胰酶消化用多大浓度，用生理液配制，还是用碳酸氢铵配制？
按照步骤消化完后能不能做个初步鉴定是不是消化下来了？第六步结束。


1．        将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下，置于eppendorf (EP) 管中, 并记录点号及相应的位置；
2．加50μL DD.H2O 超声清洗两次(或在摇床上摇晃清洗)，10min/次；
3． 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1：1溶液50μL，超声脱色5min或37℃脱色20min，吸干；
4．重复步骤3，直至蓝色褪去；
5．加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白，真空抽干5min；
6．将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍，每EP管加入适量（覆盖），稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4℃或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HCO3  至总体积10-15μL置37℃水浴，消化过夜；
7．加入2%TFA终止反应，使TFA终浓度为0.1％，振荡混匀，离心。
8.  吸出凝胶下液体（备用）。
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1楼 2013-12-17 20:21:56
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