应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 恳请各位帮我分析连接体系是否有问题
81/1返回列表
查看: 1295  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

南海所老龚

新虫 (正式写手)

[求助] 恳请各位帮我分析连接体系是否有问题 已有3人参与

各位虫友大家晚上好！
  最近一直载体自连，很是着急，发帖向各位求助，万分感激！
我的连接体系如下：
Solution 5 u,
pMD 19-T 1 u,
DNA 0.65 u,
补足水至10 u
结果载体自连相当严重。
我计算载体与插入片段依据如下（插入片段700 bp,150 ng/u）：
1u载体为0.03pm，载体：插入DNA摩尔比1:2—1:10均可，即插入片段为0.06—0.3pm,按照插入片段使用量（ng）=nmol数*660*插入片段bp数，得出使用量为28ng—138ng,换算成体积是0.187—0.92ul，连接体系中我加0.65uDNA应该是没问题的，请虫友帮我分析分析，为何这么多载体自连，谢谢各位了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
1楼 2013-12-11 21:19:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-12 16:43:27
根据说明书操作，体系应该没问题，是不是之后的操作出现问题，查缺补漏。祝早日成功
赞一下 回复此楼
我不会！
2楼2013-12-11 22:43:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-11 22:43:55
根据说明书操作，体系应该没问题，是不是之后的操作出现问题，查缺补漏。祝早日成功

虫友您好！
谢谢应助。我忘了补充了，做了阳性对照，对照的体系为：
Solution 5 u
载体 1 u
Control Insert 4u
阳性克隆达90%以上。
所以应该是连体系上出了问题
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
3楼2013-12-11 22:48:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梦里沙漠

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-12 15:32:29
DNA太少了吧，我们平时连接都不加水，5ul  Solution,0.5ul 载体，4.5ul的目的片段，连接的很好
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-12 11:14:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-12-11 22:48:15
虫友您好！
谢谢应助。我忘了补充了，做了阳性对照，对照的体系为：
Solution 5 u
载体 1 u
Control Insert 4u
阳性克隆达90%以上。
所以应该是连体系上出了问题...

突然想到一个问题，pMD是TA克隆吧？那么你的目的DNA符合TA克隆的条件不？
赞一下 回复此楼
我不会！
5楼2013-12-12 14:08:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦里沙漠 at 2013-12-12 11:14:54
DNA太少了吧，我们平时连接都不加水，5ul  Solution,0.5ul 载体，4.5ul的目的片段，连接的很好

虫友您好，因为DNA 浓度比较高，所以考虑最后补足水稀释，不过看了大家的检验后，下一步我试着不加水看看效果怎样。祝顺利！
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
6楼2013-12-12 16:03:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-12 14:08:42
突然想到一个问题，pMD是TA克隆吧？那么你的目的DNA符合TA克隆的条件不？...

TA克隆没问题的，PVR用的是奥赛博公司的聚合酶，末端加A。
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
7楼2013-12-12 16:03:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

262734003

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是该做个载体去磷酸化！
赞一下 回复此楼
8楼2013-12-13 09:05:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 南海所老龚 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 G6APbkg8SA6w 2026-08-29 4/200 2026-08-29 22:27 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 国社科申报系统有变化 +3 kynobel 2026-08-23 3/150 2026-08-29 21:57 by 余韵清
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:44 by 4qO8zhfjr2AX
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:33 by 4qO8zhfjr2AX
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 3/150 2026-08-29 21:32 by 4qO8zhfjr2AX
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:22 by 4qO8zhfjr2AX
[公派出国] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 17:30 by 4FFAWE8HcgUD
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-29 17:22 by 4FFAWE8HcgUD
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +5 gdd2018 2026-08-28 10/500 2026-08-29 14:10 by Jacob678
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-29 14:03 by jCd0dEvKHShX
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 14:02 by jCd0dEvKHShX
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 13:51 by jCd0dEvKHShX
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:40 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭