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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 恳请各位帮我分析连接体系是否有问题
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南海所老龚

新虫 (正式写手)

[求助] 恳请各位帮我分析连接体系是否有问题 已有3人参与

各位虫友大家晚上好！
  最近一直载体自连，很是着急，发帖向各位求助，万分感激！
我的连接体系如下：
Solution 5 u,
pMD 19-T 1 u,
DNA 0.65 u,
补足水至10 u
结果载体自连相当严重。
我计算载体与插入片段依据如下（插入片段700 bp,150 ng/u）：
1u载体为0.03pm，载体：插入DNA摩尔比1:2—1:10均可，即插入片段为0.06—0.3pm,按照插入片段使用量（ng）=nmol数*660*插入片段bp数，得出使用量为28ng—138ng,换算成体积是0.187—0.92ul，连接体系中我加0.65uDNA应该是没问题的，请虫友帮我分析分析，为何这么多载体自连，谢谢各位了！
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
1楼 2013-12-11 21:19:35
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-12 16:43:27
根据说明书操作，体系应该没问题，是不是之后的操作出现问题，查缺补漏。祝早日成功
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我不会！
2楼2013-12-11 22:43:55
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-11 22:43:55
根据说明书操作，体系应该没问题，是不是之后的操作出现问题，查缺补漏。祝早日成功

虫友您好！
谢谢应助。我忘了补充了，做了阳性对照，对照的体系为：
Solution 5 u
载体 1 u
Control Insert 4u
阳性克隆达90%以上。
所以应该是连体系上出了问题
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
3楼2013-12-11 22:48:15
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梦里沙漠

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-12 15:32:29
DNA太少了吧，我们平时连接都不加水，5ul  Solution,0.5ul 载体，4.5ul的目的片段，连接的很好
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4楼2013-12-12 11:14:54
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-12-11 22:48:15
虫友您好！
谢谢应助。我忘了补充了，做了阳性对照，对照的体系为：
Solution 5 u
载体 1 u
Control Insert 4u
阳性克隆达90%以上。
所以应该是连体系上出了问题...

突然想到一个问题，pMD是TA克隆吧？那么你的目的DNA符合TA克隆的条件不？
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我不会！
5楼2013-12-12 14:08:42
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦里沙漠 at 2013-12-12 11:14:54
DNA太少了吧，我们平时连接都不加水，5ul  Solution,0.5ul 载体，4.5ul的目的片段，连接的很好

虫友您好，因为DNA 浓度比较高，所以考虑最后补足水稀释，不过看了大家的检验后，下一步我试着不加水看看效果怎样。祝顺利！
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6楼2013-12-12 16:03:11
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-12 14:08:42
突然想到一个问题，pMD是TA克隆吧？那么你的目的DNA符合TA克隆的条件不？...

TA克隆没问题的，PVR用的是奥赛博公司的聚合酶，末端加A。
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7楼2013-12-12 16:03:50
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262734003

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是该做个载体去磷酸化！
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8楼2013-12-13 09:05:36
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