应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 恳请各位帮我分析连接体系是否有问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
81/1返回列表
查看: 1048  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

南海所老龚

新虫 (正式写手)

[求助] 恳请各位帮我分析连接体系是否有问题 已有3人参与

各位虫友大家晚上好！
  最近一直载体自连，很是着急，发帖向各位求助，万分感激！
我的连接体系如下：
Solution 5 u,
pMD 19-T 1 u,
DNA 0.65 u,
补足水至10 u
结果载体自连相当严重。
我计算载体与插入片段依据如下（插入片段700 bp,150 ng/u）：
1u载体为0.03pm，载体：插入DNA摩尔比1:2—1:10均可，即插入片段为0.06—0.3pm,按照插入片段使用量（ng）=nmol数*660*插入片段bp数，得出使用量为28ng—138ng,换算成体积是0.187—0.92ul，连接体系中我加0.65uDNA应该是没问题的，请虫友帮我分析分析，为何这么多载体自连，谢谢各位了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
1楼 2013-12-11 21:19:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-12 16:43:27
根据说明书操作，体系应该没问题，是不是之后的操作出现问题，查缺补漏。祝早日成功
赞一下 回复此楼
我不会！
2楼2013-12-11 22:43:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-11 22:43:55
根据说明书操作，体系应该没问题，是不是之后的操作出现问题，查缺补漏。祝早日成功

虫友您好！
谢谢应助。我忘了补充了，做了阳性对照，对照的体系为：
Solution 5 u
载体 1 u
Control Insert 4u
阳性克隆达90%以上。
所以应该是连体系上出了问题
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
3楼2013-12-11 22:48:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

梦里沙漠

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-12 15:32:29
DNA太少了吧，我们平时连接都不加水，5ul  Solution,0.5ul 载体，4.5ul的目的片段，连接的很好
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-12 11:14:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-12-11 22:48:15
虫友您好！
谢谢应助。我忘了补充了，做了阳性对照，对照的体系为：
Solution 5 u
载体 1 u
Control Insert 4u
阳性克隆达90%以上。
所以应该是连体系上出了问题...

突然想到一个问题，pMD是TA克隆吧？那么你的目的DNA符合TA克隆的条件不？
赞一下 回复此楼
我不会！
5楼2013-12-12 14:08:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦里沙漠 at 2013-12-12 11:14:54
DNA太少了吧，我们平时连接都不加水，5ul  Solution,0.5ul 载体，4.5ul的目的片段，连接的很好

虫友您好，因为DNA 浓度比较高，所以考虑最后补足水稀释，不过看了大家的检验后，下一步我试着不加水看看效果怎样。祝顺利！
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
6楼2013-12-12 16:03:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-12 14:08:42
突然想到一个问题，pMD是TA克隆吧？那么你的目的DNA符合TA克隆的条件不？...

TA克隆没问题的，PVR用的是奥赛博公司的聚合酶，末端加A。
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
7楼2013-12-12 16:03:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

262734003

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是该做个载体去磷酸化！
赞一下 回复此楼
8楼2013-12-13 09:05:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 南海所老龚 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 285求调剂 +8 AZMK 2026-04-02 11/550 2026-04-02 20:16 by yulian1987
[考研] 362求调剂 +14 西南交材料专硕3 2026-03-31 14/700 2026-04-02 17:50 by yunlongyang
[考研] 348求调剂 +6 吴彦祖24k 2026-04-02 6/300 2026-04-02 14:07 by 给你你注意休息
[考研] 初试301，代码085701环境工程，本硕一致，四六级已过，有二区一作，共发表5篇论文 +6 axibli 2026-04-01 6/300 2026-04-02 13:42 by Ecowxq666！
[考研] 270求调剂 +8 小杰pp 2026-03-31 10/500 2026-04-02 12:57 by yulian1987
[考研] 一志愿厦门大学材料工程专硕354找调剂！！！ +7 贝呗钡钡 2026-03-30 7/350 2026-04-02 12:19 by 1753564080
[考研] 求调剂！生物与医药专硕 +4 逆转陆先生 2026-04-01 4/200 2026-04-02 11:51 by xiaoranmu
[考研] 0856初试324分求调剂 +6 想上学求调 2026-04-01 6/300 2026-04-02 11:42 by 星空星月
[考研] 266分，一志愿电气工程，本科材料，求材料专业调剂 +10 哇呼哼呼哼 2026-04-01 11/550 2026-04-02 11:31 by lnilvy
[考研] 266求调剂 +4 学员97LZgn 2026-04-02 4/200 2026-04-02 09:52 by yulian1987
[考研] 材料求调剂 +10 呢呢妮妮 2026-04-01 13/650 2026-04-02 09:17 by olim
[考研] 302求调剂一志愿北航070300，本科郑大化学 +8 圣日耳曼条 2026-04-01 11/550 2026-04-02 07:40 by chemdavid
[考研] 284求调剂 +12 小熊～～ 2026-03-31 12/600 2026-04-01 20:23 by 花??
[考研] 303分 0807学硕求调剂 +3 TYC3632 2026-04-01 3/150 2026-04-01 19:24 by lwk2004
[考研] 0856 335分 +9 cccchenso 2026-03-29 9/450 2026-03-31 16:37 by lishahe
[考研] 材料工程专硕求调剂 +10 hyl3153942 2026-03-29 10/500 2026-03-31 16:31 by hypershenger
[考研] 274求调剂 +6 xiao爱同学 2026-03-30 6/300 2026-03-31 10:04 by cal0306
[考研] 085601一志愿西北工业大学初试346 +4 085601初试346 2026-03-30 4/200 2026-03-31 07:47 by jp9609
[考研] 279求调剂 +12 j的立方 2026-03-29 12/600 2026-03-30 20:30 by dick_runner
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +8 邱gl 2026-03-27 8/400 2026-03-28 12:42 by 唐沐儿
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭