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南海所老龚

新虫 (正式写手)

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[求助] 恳请各位帮我分析连接体系是否有问题已有3人参与

各位虫友大家晚上好！
最近一直载体自连，很是着急，发帖向各位求助，万分感激！
我的连接体系如下：
Solution 5 u,
pMD 19-T 1 u,
DNA 0.65 u,
补足水至10 u
结果载体自连相当严重。
我计算载体与插入片段依据如下（插入片段700 bp,150 ng/u）：
1u载体为0.03pm，载体：插入DNA摩尔比1:2—1:10均可，即插入片段为0.06—0.3pm,按照插入片段使用量（ng）=nmol数*660*插入片段bp数，得出使用量为28ng—138ng,换算成体积是0.187—0.92ul，连接体系中我加0.65uDNA应该是没问题的，请虫友帮我分析分析，为何这么多载体自连，谢谢各位了！

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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.

1楼 2013-12-11 21:19:35

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三蛰

铜虫 (小有名气)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2013-12-11 22:48:15
虫友您好！
谢谢应助。我忘了补充了，做了阳性对照，对照的体系为：
Solution 5 u
载体 1 u
Control Insert 4u
阳性克隆达90%以上。
所以应该是连体系上出了问题...

突然想到一个问题，pMD是TA克隆吧？那么你的目的DNA符合TA克隆的条件不？