应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
101/1返回列表
查看: 1422  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？

上图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），20ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（5ug）~~~条带的周围被我切的，不是传说中的杂带，
20ul体系是一孔直接上样，50ul体系的是分两孔上样的。为啥条带不在同一位置呢？
下图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），30ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（1ug）（分两孔），50ul双酶切体系（3ug）（分两孔），50ul双酶切体系（5ug）（分两孔）~~~~切了5h
我用的酶切位点是BamH1和EcoR1（二者间隔5bp），TAKARA的酶。这个到底是啥子情况 啊？为啥位置还有差别呢？是没有酶切完全？
RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？
20,50qie.JPG


RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？-1
2013.12.7R,R20,R30,R50,R50-3,R50-5=5.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
努力打败一切
1楼 2013-12-11 01:04:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:58:40
yangjingjing: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-12-11 12:42:55
你的情况明显是因为酶切不完全或者基本没有切开。从你第一张图上的质粒对照条带位置基本与你50μl切5μg持平，说明没有切开。做酶切建立反应体系时质粒的浓度不宜过高，一般是20μl体系里切1μg质粒。如果体系建得太浓，质粒的体积占总体积的比例会增加。在抽提质粒的过程中往往会有一些盐难以除干净。有些酶对盐浓度是比较敏感的。而且质粒一般溶解在TE里，EDTA对酶切反应有抑制。用50μl里切5μg质粒有些多了，虽然多加酶或者延长时间也可以达到完全切开的效果。
赞一下 回复此楼
2楼2013-12-11 09:24:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:24:04
你的情况明显是因为酶切不完全或者基本没有切开。从你第一张图上的质粒对照条带位置基本与你50μl切5μg持平，说明没有切开。做酶切建立反应体系时质粒的浓度不宜过高，一般是20μl体系里切1μg质粒。如果体系建得太 ...

那看这个情况，是20ul   1ug的是切开的了的？50ul是没有完全切开的？哎，被师兄忽悠了，我用的去核甘酸水溶的质粒~~~是试剂抽提的，不是试剂盒提的
赞一下 回复此楼
努力打败一切
3楼2013-12-11 12:42:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-11 12:42:39
那看这个情况，是20ul   1ug的是切开的了的？50ul是没有完全切开的？哎，被师兄忽悠了，我用的去核甘酸水溶的质粒~~~是试剂抽提的，不是试剂盒提的...

如果你想在50μl里切5μg也是可以的，要多加些酶或者是延长时间。如果只是切载体片段的话，确定酶切完全后（用2μl跑电泳检测）可以不用切胶回收，直接用PCR回收试剂盒或者乙醇沉淀就可以了，所以反应体系的体积不是问题。
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-11 13:28:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 13:28:17
如果你想在50μl里切5μg也是可以的，要多加些酶或者是延长时间。如果只是切载体片段的话，确定酶切完全后（用2μl跑电泳检测）可以不用切胶回收，直接用PCR回收试剂盒或者乙醇沉淀就可以了，所以反应体系的体积不 ...

看来是我太贪心了~~可是有个奇怪的现象哈~我用的是生工的胶回收试剂盒，每次回收的酶切片段只有35ng/UL（30ul洗脱）左右的的浓度，今天都酶切四孔，4ug的，也是39ng/ul（40ul洗脱），这效率也太低了啊？？？
赞一下 回复此楼
努力打败一切
5楼2013-12-11 23:09:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-11 23:09:51
看来是我太贪心了~~可是有个奇怪的现象哈~我用的是生工的胶回收试剂盒，每次回收的酶切片段只有35ng/UL（30ul洗脱）左右的的浓度，今天都酶切四孔，4ug的，也是39ng/ul（40ul洗脱），这效率也太低了啊？？？...

胶回收的效率的影响因素比较多，回收率是比PCR回收试剂盒差一点，一般超过50%就可以了。做连接用不了很多，载体片段在50-100ng就够了，目的片段根据比例来，也是在这个数量级上的，你为什么要切那么多质粒？
赞一下 回复此楼
6楼2013-12-12 02:24:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-12 02:24:07
胶回收的效率的影响因素比较多，回收率是比PCR回收试剂盒差一点，一般超过50%就可以了。做连接用不了很多，载体片段在50-100ng就够了，目的片段根据比例来，也是在这个数量级上的，你为什么要切那么多质粒？...

想着多设几个梯度连接的，可是这效率，真摸不大准回收完的量有多少，所以多设了几个梯度
赞一下 回复此楼
努力打败一切
7楼2013-12-12 20:19:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-12 20:19:19
想着多设几个梯度连接的，可是这效率，真摸不大准回收完的量有多少，所以多设了几个梯度...

如果酶切做得好，连接转化的成功率是很高的。按照最佳量和比例做就行了。
赞一下 回复此楼
8楼2013-12-13 00:22:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-13 00:22:33
如果酶切做得好，连接转化的成功率是很高的。按照最佳量和比例做就行了。...

最佳量和比例是怎样的？1：:10？
赞一下 回复此楼
努力打败一切
9楼2013-12-13 19:15:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-13 19:15:36
最佳量和比例是怎样的？1：:10？...

一般插入片段与载体大小相差不是非常大时用1:3或者1:4。如果插入片段很小，用1:10。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-12-14 00:48:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yangjingjing 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 275求调剂 +10 Micky11223 2026-03-25 12/600 2026-03-27 09:41 by caszguilin
[考研] 348求调剂 +3 小懒虫不懒了 2026-03-27 3/150 2026-03-27 04:30 by wxiongid
[考研] 考研调剂 +9 呼呼？~+123456 2026-03-24 9/450 2026-03-27 03:47 by wxiongid
[考研] 一志愿太原理工安全工程300分，求调剂 +3 0857求调剂. 2026-03-24 3/150 2026-03-27 01:18 by 求知若渴lz
[考研] 材料学硕333求调剂 +7 北道巷 2026-03-24 7/350 2026-03-27 00:30 by wxiongid
[考研] 342求调剂 +3 加油a李zs 2026-03-26 3/150 2026-03-27 00:29 by wxiongid
[考研] 07化学280分求调剂 +8 722865 2026-03-23 8/400 2026-03-26 20:00 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿 西北大学 总分282 英语一62 求调剂 +7 18419759900 2026-03-25 7/350 2026-03-26 16:07 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿河工大 081700 276求调剂 +4 地球绕着太阳转 2026-03-23 4/200 2026-03-26 14:27 by zzll406
[考研] 263求调剂 +6 yqdszhdap－ 2026-03-22 10/500 2026-03-26 13:11 by 公瑾逍遥
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856材料化工 | GPA 4.07 | 有科研经历 +6 cccchenso 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:25 by 544594351
[考研] 材料求调剂 +4 .m.. 2026-03-25 4/200 2026-03-25 21:30 by peike
[考研] 296求调剂 +4 汪！？！ 2026-03-25 7/350 2026-03-25 16:41 by 汪！？！
[考研] 302求调剂 +4 锦衣卫藤椒 2026-03-25 4/200 2026-03-25 16:29 by 功夫疯狂
[考研] 考研化学308分求调剂 +10 你好明天你好 2026-03-23 11/550 2026-03-25 10:23 by userper
[考研] 070300化学求调剂 +9 苑豆豆 2026-03-20 9/450 2026-03-24 17:15 by licg0208
[考研] 291求调剂 +3 HanBeiNingZC 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:34 by barlinike
[考研] 307求调剂 +5 超级伊昂大王 2026-03-24 5/250 2026-03-24 15:46 by 星空星月
[考研] 工科0856求调剂 +5 沐析汀汀 2026-03-21 5/250 2026-03-23 17:56 by 海瑟薇-
[考研] 0805材料320求调剂 +3 深海物语 2026-03-20 3/150 2026-03-21 15:46 by 无际的草原
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭