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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？

上图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），20ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（5ug）~~~条带的周围被我切的，不是传说中的杂带，
20ul体系是一孔直接上样，50ul体系的是分两孔上样的。为啥条带不在同一位置呢？
下图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），30ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（1ug）（分两孔），50ul双酶切体系（3ug）（分两孔），50ul双酶切体系（5ug）（分两孔）~~~~切了5h
我用的酶切位点是BamH1和EcoR1（二者间隔5bp），TAKARA的酶。这个到底是啥子情况 啊？为啥位置还有差别呢？是没有酶切完全？
RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？
20,50qie.JPG


RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？-1
2013.12.7R,R20,R30,R50,R50-3,R50-5=5.JPG
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努力打败一切
1楼 2013-12-11 01:04:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:58:40
yangjingjing: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-12-11 12:42:55
你的情况明显是因为酶切不完全或者基本没有切开。从你第一张图上的质粒对照条带位置基本与你50μl切5μg持平，说明没有切开。做酶切建立反应体系时质粒的浓度不宜过高，一般是20μl体系里切1μg质粒。如果体系建得太浓，质粒的体积占总体积的比例会增加。在抽提质粒的过程中往往会有一些盐难以除干净。有些酶对盐浓度是比较敏感的。而且质粒一般溶解在TE里，EDTA对酶切反应有抑制。用50μl里切5μg质粒有些多了，虽然多加酶或者延长时间也可以达到完全切开的效果。
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2楼2013-12-11 09:24:04
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:24:04
你的情况明显是因为酶切不完全或者基本没有切开。从你第一张图上的质粒对照条带位置基本与你50μl切5μg持平，说明没有切开。做酶切建立反应体系时质粒的浓度不宜过高，一般是20μl体系里切1μg质粒。如果体系建得太 ...

那看这个情况，是20ul   1ug的是切开的了的？50ul是没有完全切开的？哎，被师兄忽悠了，我用的去核甘酸水溶的质粒~~~是试剂抽提的，不是试剂盒提的
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努力打败一切
3楼2013-12-11 12:42:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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3楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-11 12:42:39
那看这个情况，是20ul   1ug的是切开的了的？50ul是没有完全切开的？哎，被师兄忽悠了，我用的去核甘酸水溶的质粒~~~是试剂抽提的，不是试剂盒提的...

如果你想在50μl里切5μg也是可以的，要多加些酶或者是延长时间。如果只是切载体片段的话，确定酶切完全后（用2μl跑电泳检测）可以不用切胶回收，直接用PCR回收试剂盒或者乙醇沉淀就可以了，所以反应体系的体积不是问题。
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4楼2013-12-11 13:28:17
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
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4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 13:28:17
如果你想在50μl里切5μg也是可以的，要多加些酶或者是延长时间。如果只是切载体片段的话，确定酶切完全后（用2μl跑电泳检测）可以不用切胶回收，直接用PCR回收试剂盒或者乙醇沉淀就可以了，所以反应体系的体积不 ...

看来是我太贪心了~~可是有个奇怪的现象哈~我用的是生工的胶回收试剂盒，每次回收的酶切片段只有35ng/UL（30ul洗脱）左右的的浓度，今天都酶切四孔，4ug的，也是39ng/ul（40ul洗脱），这效率也太低了啊？？？
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5楼2013-12-11 23:09:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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5楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-11 23:09:51
看来是我太贪心了~~可是有个奇怪的现象哈~我用的是生工的胶回收试剂盒，每次回收的酶切片段只有35ng/UL（30ul洗脱）左右的的浓度，今天都酶切四孔，4ug的，也是39ng/ul（40ul洗脱），这效率也太低了啊？？？...

胶回收的效率的影响因素比较多，回收率是比PCR回收试剂盒差一点，一般超过50%就可以了。做连接用不了很多，载体片段在50-100ng就够了，目的片段根据比例来，也是在这个数量级上的，你为什么要切那么多质粒？
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6楼2013-12-12 02:24:07
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-12 02:24:07
胶回收的效率的影响因素比较多，回收率是比PCR回收试剂盒差一点，一般超过50%就可以了。做连接用不了很多，载体片段在50-100ng就够了，目的片段根据比例来，也是在这个数量级上的，你为什么要切那么多质粒？...

想着多设几个梯度连接的，可是这效率，真摸不大准回收完的量有多少，所以多设了几个梯度
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7楼2013-12-12 20:19:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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7楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-12 20:19:19
想着多设几个梯度连接的，可是这效率，真摸不大准回收完的量有多少，所以多设了几个梯度...

如果酶切做得好，连接转化的成功率是很高的。按照最佳量和比例做就行了。
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8楼2013-12-13 00:22:33
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yangjingjing

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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-13 00:22:33
如果酶切做得好，连接转化的成功率是很高的。按照最佳量和比例做就行了。...

最佳量和比例是怎样的？1：:10？
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9楼2013-12-13 19:15:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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9楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-13 19:15:36
最佳量和比例是怎样的？1：:10？...

一般插入片段与载体大小相差不是非常大时用1:3或者1:4。如果插入片段很小，用1:10。
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10楼2013-12-14 00:48:26
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