应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？
51/1返回列表
查看: 1631  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？

上图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），20ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（5ug）~~~条带的周围被我切的，不是传说中的杂带，
20ul体系是一孔直接上样，50ul体系的是分两孔上样的。为啥条带不在同一位置呢？
下图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），30ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（1ug）（分两孔），50ul双酶切体系（3ug）（分两孔），50ul双酶切体系（5ug）（分两孔）~~~~切了5h
我用的酶切位点是BamH1和EcoR1（二者间隔5bp），TAKARA的酶。这个到底是啥子情况 啊？为啥位置还有差别呢？是没有酶切完全？
RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？
20,50qie.JPG


RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？-1
2013.12.7R,R20,R30,R50,R50-3,R50-5=5.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
努力打败一切
1楼 2013-12-11 01:04:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 13:28:17
如果你想在50μl里切5μg也是可以的，要多加些酶或者是延长时间。如果只是切载体片段的话，确定酶切完全后（用2μl跑电泳检测）可以不用切胶回收，直接用PCR回收试剂盒或者乙醇沉淀就可以了，所以反应体系的体积不 ...

看来是我太贪心了~~可是有个奇怪的现象哈~我用的是生工的胶回收试剂盒，每次回收的酶切片段只有35ng/UL（30ul洗脱）左右的的浓度，今天都酶切四孔，4ug的，也是39ng/ul（40ul洗脱），这效率也太低了啊？？？
赞一下 回复此楼
努力打败一切
5楼2013-12-11 23:09:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-11 09:58:40
yangjingjing: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2013-12-11 12:42:55
你的情况明显是因为酶切不完全或者基本没有切开。从你第一张图上的质粒对照条带位置基本与你50μl切5μg持平，说明没有切开。做酶切建立反应体系时质粒的浓度不宜过高，一般是20μl体系里切1μg质粒。如果体系建得太浓，质粒的体积占总体积的比例会增加。在抽提质粒的过程中往往会有一些盐难以除干净。有些酶对盐浓度是比较敏感的。而且质粒一般溶解在TE里，EDTA对酶切反应有抑制。用50μl里切5μg质粒有些多了，虽然多加酶或者延长时间也可以达到完全切开的效果。
赞一下 回复此楼
2楼2013-12-11 09:24:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-11 09:24:04
你的情况明显是因为酶切不完全或者基本没有切开。从你第一张图上的质粒对照条带位置基本与你50μl切5μg持平，说明没有切开。做酶切建立反应体系时质粒的浓度不宜过高，一般是20μl体系里切1μg质粒。如果体系建得太 ...

那看这个情况，是20ul   1ug的是切开的了的？50ul是没有完全切开的？哎，被师兄忽悠了，我用的去核甘酸水溶的质粒~~~是试剂抽提的，不是试剂盒提的
赞一下 回复此楼
努力打败一切
3楼2013-12-11 12:42:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-11 12:42:39
那看这个情况，是20ul   1ug的是切开的了的？50ul是没有完全切开的？哎，被师兄忽悠了，我用的去核甘酸水溶的质粒~~~是试剂抽提的，不是试剂盒提的...

如果你想在50μl里切5μg也是可以的，要多加些酶或者是延长时间。如果只是切载体片段的话，确定酶切完全后（用2μl跑电泳检测）可以不用切胶回收，直接用PCR回收试剂盒或者乙醇沉淀就可以了，所以反应体系的体积不是问题。
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-11 13:28:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +31 医学老男孩 2026-08-13 69/3450 2026-08-16 00:16 by mo_mo_mo_mo
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +9 majunge000 2026-08-11 11/550 2026-08-15 23:20 by botar
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +12 archvillain 2026-08-15 23/1150 2026-08-15 20:47 by foyo404
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +12 Tide man 2026-08-10 13/650 2026-08-15 16:34 by 氺木
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +7 Ldrop2023 2026-08-13 7/350 2026-08-15 15:57 by mzhh2000
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭