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yangjingjing木虫 (正式写手)
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RetroQ质粒不同体系双酶切，怎么会出现不同的带？
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上图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），20ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（5ug）~~~条带的周围被我切的，不是传说中的杂带， 20ul体系是一孔直接上样，50ul体系的是分两孔上样的。为啥条带不在同一位置呢？ 下图左起Marker，RetroQ质粒，20u双l酶切体系（1ug质粒），30ul双酶切体系（1ug质粒），50ul双酶切体系（1ug）（分两孔），50ul双酶切体系（3ug）（分两孔），50ul双酶切体系（5ug）（分两孔）~~~~切了5h 我用的酶切位点是BamH1和EcoR1（二者间隔5bp），TAKARA的酶。这个到底是啥子情况 啊？为啥位置还有差别呢？是没有酶切完全？  20,50qie.JPG  2013.12.7R,R20,R30,R50,R50-3,R50-5=5.JPG |
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yangjingjing
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3楼2013-12-11 12:42:39
cicelyzh
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【答案】应助回帖
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| 你的情况明显是因为酶切不完全或者基本没有切开。从你第一张图上的质粒对照条带位置基本与你50μl切5μg持平，说明没有切开。做酶切建立反应体系时质粒的浓度不宜过高，一般是20μl体系里切1μg质粒。如果体系建得太浓，质粒的体积占总体积的比例会增加。在抽提质粒的过程中往往会有一些盐难以除干净。有些酶对盐浓度是比较敏感的。而且质粒一般溶解在TE里，EDTA对酶切反应有抑制。用50μl里切5μg质粒有些多了，虽然多加酶或者延长时间也可以达到完全切开的效果。 |
2楼2013-12-11 09:24:04
cicelyzh
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4楼2013-12-11 13:28:17
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看来是我太贪心了~~可是有个奇怪的现象哈~我用的是生工的胶回收试剂盒，每次回收的酶切片段只有35ng/UL（30ul洗脱）左右的的浓度，今天都酶切四孔，4ug的，也是39ng/ul（40ul洗脱），这效率也太低了啊？？？ 5楼2013-12-11 23:09:51
