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EMSA看不见任何带，求助求助已有1人参与
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最近在做EMSA,自己以前没有做过啊，配置了以下试剂， Binding Buffer (store at -20℃) 10mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM DTT 0.2mM, 0.05% NP-40, 10% glycerol, pH 7.4 配置非变性聚丙烯酰胺凝胶(以6％浓度为例) 5×TBE 1mL 30％Ac-Bi 2mL 40％Glycerin 625μl DDW 3.125Ml 10%AP 150μl 10%TEMED 100μl 以预冷为4℃的0.5×TBE为电泳缓冲液，100V预电泳30-60min 我的DNA是单链，5‘FAM标记，退火后加入Binding Buffer，细胞核蛋白孵育1h后加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上样10－20μl，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。 但是结果如下图，没有条带，而后我又用不带标记的DNA与蛋白孵育以后进行EMSA，然后用EB染胶，发现DNA都在加样孔处，且呈现梯度增加（几个孔所加DNA含量相等，但是细胞核蛋白梯度增加）。下图由右至左：Marker,DNA,细胞核蛋白，之后的几个孔都是DNA+细胞核蛋白，且细胞核蛋白浓度增加。 有一个奇怪的现象就是Marker的孔下方也会有亮亮的弯曲的条带，不知道是什么东西？ 哪位大侠看看如何改进？万分感谢啊！实验就差这最后的一个实验了。。。。  dell 2013-12-04 14 时 44 分.JPG  dell 2013-12-04 14 时 42 分.JPG [ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:32 ] |
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