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sageyaya

新虫 (初入文坛)

[求助] EMSA看不见任何带，求助求助 已有1人参与

最近在做EMSA,自己以前没有做过啊，配置了以下试剂，
Binding Buffer (store at -20℃)
10mM     HEPES,     50 mM    KCl,         1mM      DTT     0.2mM, 0.05% NP-40,     10%      glycerol, pH 7.4
配置非变性聚丙烯酰胺凝胶(以6％浓度为例)
5×TBE                       1mL
30％Ac-Bi                    2mL
40％Glycerin                      625μl
DDW                            3.125Ml
10%AP                           150μl
10%TEMED                       100μl
以预冷为4℃的0.5×TBE为电泳缓冲液，100V预电泳30-60min

我的DNA是单链，5‘FAM标记，退火后加入Binding Buffer，细胞核蛋白孵育1h后加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上样10－20μl，100V电泳至溴酚蓝于三分之二处。
但是结果如下图，没有条带，而后我又用不带标记的DNA与蛋白孵育以后进行EMSA，然后用EB染胶，发现DNA都在加样孔处，且呈现梯度增加（几个孔所加DNA含量相等，但是细胞核蛋白梯度增加）。下图由右至左：Marker,DNA,细胞核蛋白，之后的几个孔都是DNA+细胞核蛋白，且细胞核蛋白浓度增加。
有一个奇怪的现象就是Marker的孔下方也会有亮亮的弯曲的条带，不知道是什么东西？
哪位大侠看看如何改进？万分感谢啊！实验就差这最后的一个实验了。。。。
EMSA看不见任何带，求助求助
dell 2013-12-04 14 时 44 分.JPG


EMSA看不见任何带，求助求助-1
dell 2013-12-04 14 时 42 分.JPG

[ Last edited by silicare on 2014-2-26 at 16:32 ]
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1楼 2013-12-04 16:57:25
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sageyaya

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-12-05 07:41:16
你是不是曝光过度了，
有2个小白点啊

找你老师买个试剂盒再做做看

。。。。。

没有曝光过度，是我调的，能够看到在孔的地方有下边缘有亮的，传上来好像不是很明显了，试剂盒问了，由于我的是FAM标记的，没有找到能够用的试剂盒啊。。。。
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3楼2013-12-05 09:36:16
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是不是曝光过度了，
有2个小白点啊

找你老师买个试剂盒再做做看

。。。。。
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2楼2013-12-05 07:41:16
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cc1000ml

金虫 (正式写手)
你好，不知道你最后做出来没?想请教一下你的6X的上样buffer是TAKARA的，货号能告诉我一下么
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徐无鬼
4楼2014-09-17 09:22:12
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allegory

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2014-11-07 23:06:40
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查看全部 8 个回答
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