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1楼2013-11-21 16:23:58

zzl2516

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-21 16:57:15

一步法是什么方法。。。从来没用过一步法。。就图形来看你这个扩增曲线都没有到平台期，现在不都是用两步法或三步法么，建议改为两步法

2楼2013-11-21 16:49:06

love_st

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你的凌乱是指你各个梯度的重复做的不好还是什么？

3楼2013-11-21 16:58:20

linsui1989

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3楼: Originally posted by love_st at 2013-11-21 16:58:20
你的凌乱是指你各个梯度的重复做的不好还是什么？

我是10倍梯度稀释的标准品，从10的10次方开始加样，不仅重复性不好，而且PCR起峰很晚，尤其是第二张图，起峰时间都集中在后半段，根本没有梯度间的差别。
我之前建的另一个种病毒RNA的标准曲线就很稳定，（附图），实在找不出其中的原因

lin10.24。正式.sds_AmpPlot.jpg

4楼2013-11-21 19:07:25

love_st

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gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-11-22 16:40:53

引用回帖:

4楼: Originally posted by linsui1989 at 2013-11-21 19:07:25
我是10倍梯度稀释的标准品，从10的10次方开始加样，不仅重复性不好，而且PCR起峰很晚，尤其是第二张图，起峰时间都集中在后半段，根本没有梯度间的差别。
我之前建的另一个种病毒RNA的标准曲线就很稳定，（附图） ...

1.你的最高浓度如果是10次方的话，Ct值是偏大了点，这个可能和你引物探针扩增效率有关系，还有你的重复性不好，低浓度扩增不好，可能和你体系有关系，试着去优化下体系，调整下各试剂组份浓度，特别是你所用的酶，即使同样的酶，对于不同体系它的比例也不尽相同，都去做些许调整吧，可能会取得好的结果。
2.重复性不好除了体系的问题，很多时候是操作者的操作手法等问题，请相信，虽然PCR是个相对简单的实验，但是想做好并不是简单的事情，一两次的实验不能说明任何问题。

5楼2013-11-22 09:09:29