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linsui1989

新虫 (小有名气)

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[求助] 荧光定量求大神赐教~~~

我最近用RNA做标准品在建标准曲线，用的是一步法RT-PCR方法，两次做出来的曲线都很凌乱，附图两张，求分析解释。根据分光光度计的结果显示标准品原液浓度大约是10的12次方个copies，260/280=2.00, 260/230=1.69, 求分析解释。

sample2(1).sds_AmpPlot.jpg

sample2(2).sds_AmpPlot.jpg

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1楼 2013-11-21 16:23:58

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love_st

金虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-11-22 16:40:53

引用回帖:

4楼: Originally posted by linsui1989 at 2013-11-21 19:07:25
我是10倍梯度稀释的标准品，从10的10次方开始加样，不仅重复性不好，而且PCR起峰很晚，尤其是第二张图，起峰时间都集中在后半段，根本没有梯度间的差别。
我之前建的另一个种病毒RNA的标准曲线就很稳定，（附图） ...

1.你的最高浓度如果是10次方的话，Ct值是偏大了点，这个可能和你引物探针扩增效率有关系，还有你的重复性不好，低浓度扩增不好，可能和你体系有关系，试着去优化下体系，调整下各试剂组份浓度，特别是你所用的酶，即使同样的酶，对于不同体系它的比例也不尽相同，都去做些许调整吧，可能会取得好的结果。
2.重复性不好除了体系的问题，很多时候是操作者的操作手法等问题，请相信，虽然PCR是个相对简单的实验，但是想做好并不是简单的事情，一两次的实验不能说明任何问题。