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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胞外蛋白质相互作用的方法
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)

[求助] 胞外蛋白质相互作用的方法已有1人参与

纯化得到2种蛋白质，其中一种是酶一种是辅助蛋白，怎样做他们之间的相互作用？难道混合在一起看酶活怎样？求高手指点
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1楼2013-11-20 15:18:42
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-20 17:51:18
蛋白质直接的互作应该做免疫共沉淀吧，貌似有个pull down
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求是
2楼2013-11-20 17:08:35
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jennifermatt at 2013-11-20 17:08:35
蛋白质直接的互作应该做免疫共沉淀吧，貌似有个pull down

这个是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法吧？我是想在体外看他们之间有没有相互作用，不知道有没有人做过这种？
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3楼2013-11-21 10:13:41
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:40:57
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
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求是
4楼2013-11-21 10:26:10
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jennifermatt at 2013-11-21 10:26:10
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解 ...

哦 好像明白了，可是我怎么知道这个蛋白的抗体是什么那？
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5楼2013-11-21 10:45:26
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jennifermatt at 2013-11-21 10:26:10
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解 ...

实验室没人做过这个,我也一点都不懂,谢谢你的帮助
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6楼2013-11-21 10:52:11
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这个需要查找 对应的单抗了。
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求是
7楼2013-11-27 10:20:04
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:41:26
免疫沉淀 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。
考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
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求是
8楼2013-11-27 10:23:09
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woai43

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-27 12:41:35
体外相互作用可以采用GST-pull down的实验，将一个蛋白A与GST标签偶联大肠杆菌纯化，不需要谷胱甘肽洗脱。另一个蛋白B可以用his标签大肠杆菌纯化，将两个蛋白混合（加入BSA竞争非特异性结合），通过离心GST beads将A蛋白离心于管底，B蛋白如与A有相互作用，则也能够被拉下来，通过3-5次洗涤，SDS-PAGE，可考染也可WB分析。
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9楼2013-11-27 10:57:13
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zhenxiangkai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

ITC就可以啊 你可以尝试一下
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10楼2013-11-27 18:55:28
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