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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法
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chrisluxal

新虫 (小有名气)

[求助] 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法

最近准备将两个段片段 A:150bp B:24bp 连接起来，再接入EGFP载体，进行下一步工作，现在遇到的问题是如何才能精确地不要多余碱基的情况下获得这两个片段，使其能够正常的转录和翻译？
望各位不吝赐教！
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人生来自由
1楼 2013-11-07 23:41:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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chrisluxal: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:03:35
就是设计2个引物：一个引物：包括一半你的24pb的碱基+你原来的引物序列，这样就PCR产物就变成：12bp碱基加你的150bp的序列； 之后拿这个PCR产物当模板，再设计一个新的引物，加上另外的一半12bp碱基，再做一次PCR，这次就能得到你要的24bp+150bp的序列了。第2次的引物可以加上酶切位点和保护碱基。
其实引物太长没什么关系，主要是TM值会太高，和你延伸温度差不多的话就很难PCR了。而且你加太多的其他序列在你的引物里，你引物的特异性就不会很好了。如果分两次还觉得引物太长，就分3次做，每次加8个bp。
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21楼2013-11-09 05:21:56
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happy1985

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 01:16:44
用短片段并加入几个长片段的碱基作为一端引物，再以长片段的另一端为另一个引物，当然引物两端都要加上限制性酶切位点，然后pcr，纯化，酶切，连接，转化。
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穿越黑暗必是阳光普照
2楼2013-11-07 23:48:30
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把24bp设计在引物里面，然后去PCR那个150bp的片段，再连接如EGFP载体，这样成功率会更高一些
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3楼2013-11-08 01:17:41
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happy1985

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 10:38:07
引用回帖:
4楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 01:36:44
我先尝试一下把这24bp怎么放在引物设计里面！是直接用这24bp作为引物序列么？非常感谢！！...

要24bp的序列一端加上150bp的几个碱基，一端加上酶切位点作为一条引物，有可能引物会有点长，不过可以试试看，成功几率应该挺高的。
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穿越黑暗必是阳光普照
6楼2013-11-08 02:13:18
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gyesang

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【答案】应助回帖

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chrisluxal: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:04:34
引用回帖:
9楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 21:59:37
我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样 ...

15bp延长至20bp也没有问题，大胆的做吧，没问题的
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12楼2013-11-08 23:23:14
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plantvirus

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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overlap PCR 可以解决你的问题的，你可以试试
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Imaginationismoreimportantthanknowledge！
20楼2013-11-09 02:09:18
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普通回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-07 23:48:30
用短片段并加入几个长片段的碱基作为一端引物，再以长片段的另一端为另一个引物，当然引物两端都要加上限制性酶切位点，然后pcr，纯化，酶切，连接，转化。

我先尝试一下把这24bp怎么放在引物设计里面！是直接用这24bp作为引物序列么？非常感谢！！
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人生来自由
4楼2013-11-08 01:36:44
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-08 01:17:41
把24bp设计在引物里面，然后去PCR那个150bp的片段，再连接如EGFP载体，这样成功率会更高一些

是直接用这24bp作为引物么？我先尝试一下！非常感谢！
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人生来自由
5楼2013-11-08 01:38:23
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-08 02:13:18
要24bp的序列一端加上150bp的几个碱基，一端加上酶切位点作为一条引物，有可能引物会有点长，不过可以试试看，成功几率应该挺高的。...

好的！我刚刚整了一下，希望这样可以成功！非常感谢！
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人生来自由
7楼2013-11-08 02:42:54
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gyesang

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【答案】应助回帖

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5楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 01:38:23
是直接用这24bp作为引物么？我先尝试一下！非常感谢！...

不是直接作为引物，而是把这24bp设计在针对150bp引物的5‘端，具体的你再看看
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2013-11-08 10:39:20
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-08 10:39:20
不是直接作为引物，而是把这24bp设计在针对150bp引物的5‘端，具体的你再看看...

我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样的话我的引物直接就有39bp了，而且还有二级结构，感觉问题不太好解决。这要怎么看么？非常感谢！
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人生来自由
9楼2013-11-08 21:59:37
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-08 02:13:18
要24bp的序列一端加上150bp的几个碱基，一端加上酶切位点作为一条引物，有可能引物会有点长，不过可以试试看，成功几率应该挺高的。...

另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！
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人生来自由
10楼2013-11-08 22:37:26
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