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chrisluxal

新虫 (小有名气)

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专业: 细胞、亚细胞结构与功能

[求助] 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法

最近准备将两个段片段 A:150bp B:24bp 连接起来，再接入EGFP载体，进行下一步工作，现在遇到的问题是如何才能精确地不要多余碱基的情况下获得这两个片段，使其能够正常的转录和翻译？
望各位不吝赐教！

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人生来自由

1楼2013-11-07 23:41:44

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sun_in_night

木虫 (小有名气)

应助: 51 (初中生)
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专业: 植物遗传学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chrisluxal: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:03:35

就是设计2个引物：一个引物：包括一半你的24pb的碱基+你原来的引物序列，这样就PCR产物就变成：12bp碱基加你的150bp的序列；之后拿这个PCR产物当模板，再设计一个新的引物，加上另外的一半12bp碱基，再做一次PCR，这次就能得到你要的24bp+150bp的序列了。第2次的引物可以加上酶切位点和保护碱基。
其实引物太长没什么关系，主要是TM值会太高，和你延伸温度差不多的话就很难PCR了。而且你加太多的其他序列在你的引物里，你引物的特异性就不会很好了。如果分两次还觉得引物太长，就分3次做，每次加8个bp。