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sun_in_night

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chrisluxal: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:03:35

就是设计2个引物：一个引物：包括一半你的24pb的碱基+你原来的引物序列，这样就PCR产物就变成：12bp碱基加你的150bp的序列；之后拿这个PCR产物当模板，再设计一个新的引物，加上另外的一半12bp碱基，再做一次PCR，这次就能得到你要的24bp+150bp的序列了。第2次的引物可以加上酶切位点和保护碱基。
其实引物太长没什么关系，主要是TM值会太高，和你延伸温度差不多的话就很难PCR了。而且你加太多的其他序列在你的引物里，你引物的特异性就不会很好了。如果分两次还觉得引物太长，就分3次做，每次加8个bp。

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21楼2013-11-09 05:21:56

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chrisluxal

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引用回帖:

21楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-09 05:21:56
就是设计2个引物：一个引物：包括一半你的24pb的碱基+你原来的引物序列，这样就PCR产物就变成：12bp碱基加你的150bp的序列；之后拿这个PCR产物当模板，再设计一个新的引物，加上另外的一半12bp碱基，再做一次PCR， ...

明白了 overlap PCR,这样成功率应该会比较高！好的！非常感谢！！

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人生来自由

22楼2013-11-09 07:06:31

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kehan777

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引用回帖:

16楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-09 00:52:55
加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物 ...

这样的话，你说的酶切后跟长片段连接，那么还有载体呢？三个能同时连接吗？能否分两次，先把长片段连接进去，再切开，和短片段连？

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23楼2013-11-09 10:02:57

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