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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知(长期有效)
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
chrisluxal: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:03:35
就是设计2个引物:一个引物:包括一半你的24pb的碱基+你原来的引物序列,这样就PCR产物就变成:12bp碱基加你的150bp的序列; 之后拿这个PCR产物当模板,再设计一个新的引物,加上另外的一半12bp碱基,再做一次PCR,这次就能得到你要的24bp+150bp的序列了。第2次的引物可以加上酶切位点和保护碱基。
其实引物太长没什么关系,主要是TM值会太高,和你延伸温度差不多的话就很难PCR了。而且你加太多的其他序列在你的引物里,你引物的特异性就不会很好了。如果分两次还觉得引物太长,就分3次做,每次加8个bp。
21楼2013-11-09 05:21:56
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chrisluxal

新虫 (小有名气)

引用回帖:
21楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-09 05:21:56
就是设计2个引物:一个引物:包括一半你的24pb的碱基+你原来的引物序列,这样就PCR产物就变成:12bp碱基加你的150bp的序列; 之后拿这个PCR产物当模板,再设计一个新的引物,加上另外的一半12bp碱基,再做一次PCR, ...

明白了 overlap PCR,这样成功率应该会比较高!好的!非常感谢!!
人生来自由
22楼2013-11-09 07:06:31
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kehan777

木虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-09 00:52:55
加linker会好点,我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边,看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物,到时直接拿这两个引物 ...

这样的话,你说的酶切后跟长片段连接,那么还有载体呢?三个能同时连接吗?能否分两次,先把长片段连接进去,再切开,和短片段连?
23楼2013-11-09 10:02:57
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