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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法
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chrisluxal

新虫 (小有名气)

[求助] 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法

最近准备将两个段片段 A:150bp B:24bp 连接起来，再接入EGFP载体，进行下一步工作，现在遇到的问题是如何才能精确地不要多余碱基的情况下获得这两个片段，使其能够正常的转录和翻译？
望各位不吝赐教！
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人生来自由
1楼 2013-11-07 23:41:44
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-09 05:21:56
就是设计2个引物：一个引物：包括一半你的24pb的碱基+你原来的引物序列，这样就PCR产物就变成：12bp碱基加你的150bp的序列； 之后拿这个PCR产物当模板，再设计一个新的引物，加上另外的一半12bp碱基，再做一次PCR， ...

明白了 overlap PCR,这样成功率应该会比较高！好的！非常感谢！！
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人生来自由
22楼2013-11-09 07:06:31
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happy1985

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 01:16:44
用短片段并加入几个长片段的碱基作为一端引物，再以长片段的另一端为另一个引物，当然引物两端都要加上限制性酶切位点，然后pcr，纯化，酶切，连接，转化。
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穿越黑暗必是阳光普照
2楼2013-11-07 23:48:30
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把24bp设计在引物里面，然后去PCR那个150bp的片段，再连接如EGFP载体，这样成功率会更高一些
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-11-08 01:17:41
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-07 23:48:30
用短片段并加入几个长片段的碱基作为一端引物，再以长片段的另一端为另一个引物，当然引物两端都要加上限制性酶切位点，然后pcr，纯化，酶切，连接，转化。

我先尝试一下把这24bp怎么放在引物设计里面！是直接用这24bp作为引物序列么？非常感谢！！
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人生来自由
4楼2013-11-08 01:36:44
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