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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法
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chrisluxal

新虫 (小有名气)

[求助] 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法

最近准备将两个段片段 A:150bp B:24bp 连接起来，再接入EGFP载体，进行下一步工作，现在遇到的问题是如何才能精确地不要多余碱基的情况下获得这两个片段，使其能够正常的转录和翻译？
望各位不吝赐教！
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人生来自由
1楼 2013-11-07 23:41:44
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happy1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 22:37:26
另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！...

加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物pcr，估计可能也有50bp左右，应该可以回收，酶切后跟那个长片段连接，可能这样更好些。
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穿越黑暗必是阳光普照
16楼2013-11-09 00:52:55
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happy1985

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-08 01:16:44
用短片段并加入几个长片段的碱基作为一端引物，再以长片段的另一端为另一个引物，当然引物两端都要加上限制性酶切位点，然后pcr，纯化，酶切，连接，转化。
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穿越黑暗必是阳光普照
2楼2013-11-07 23:48:30
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把24bp设计在引物里面，然后去PCR那个150bp的片段，再连接如EGFP载体，这样成功率会更高一些
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-11-08 01:17:41
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-07 23:48:30
用短片段并加入几个长片段的碱基作为一端引物，再以长片段的另一端为另一个引物，当然引物两端都要加上限制性酶切位点，然后pcr，纯化，酶切，连接，转化。

我先尝试一下把这24bp怎么放在引物设计里面！是直接用这24bp作为引物序列么？非常感谢！！
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人生来自由
4楼2013-11-08 01:36:44
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