应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法
232/3返回列表上一页123下一页
查看: 2124  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kehan777

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 22:37:26
另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！...


保护性碱基+酶切位点+24bp+引物序列（15），可不止39bp哦，这么长的引物序列，P起来有难度，成功的话，就把电泳图发出来给我们借鉴啊，加油！！
赞一下 回复此楼
11楼2013-11-08 23:16:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
chrisluxal: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:04:34
引用回帖:
9楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 21:59:37
我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样 ...

15bp延长至20bp也没有问题，大胆的做吧，没问题的
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
12楼2013-11-08 23:23:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by kehan777 at 2013-11-08 23:16:24

保护性碱基+酶切位点+24bp+引物序列（15），可不止39bp哦，这么长的引物序列，P起来有难度，成功的话，就把电泳图发出来给我们借鉴啊，加油！！...

39bp是指除了酶切位点和保护碱基以外的序列 呵呵 不好意思哈 没说清楚
赞一下 回复此楼
人生来自由
13楼2013-11-09 00:08:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-08 23:23:14
15bp延长至20bp也没有问题，大胆的做吧，没问题的...

刚给老板讲完 看看是否同意我这么做！非常感谢！
赞一下 回复此楼
人生来自由
14楼2013-11-09 00:10:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 21:59:37
我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样 ...

目的片段应该不用这么长吧，可能10左右就差不多了，但是具体的话得实验做了才知道啊，因为酶切位点啥的都不能改，所以只能试试看。你可以调整下保护碱基，看看会不会好点。
赞一下 回复此楼
穿越黑暗必是阳光普照
15楼2013-11-09 00:44:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 22:37:26
另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！...

加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物pcr，估计可能也有50bp左右，应该可以回收，酶切后跟那个长片段连接，可能这样更好些。
赞一下 回复此楼
穿越黑暗必是阳光普照
16楼2013-11-09 00:52:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sun_in_night

木虫 (小有名气)
觉得引物太长就分两次PCR，一次加12个碱基在你的引物上，第二次再加十二个碱基和酶切位点
赞一下 回复此楼
17楼2013-11-09 00:56:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-09 00:52:55
加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物 ...

我也觉得这样应该会更好些，不过我的确是想要这两个连在一起，我再考虑一下！非常感谢！
赞一下 回复此楼
人生来自由
18楼2013-11-09 01:40:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-09 00:56:56
觉得引物太长就分两次PCR，一次加12个碱基在你的引物上，第二次再加十二个碱基和酶切位点

不好意思  有点不太明白你的意思，能不能再具体一点呢？谢谢！
赞一下 回复此楼
人生来自由
19楼2013-11-09 01:50:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

plantvirus

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
overlap PCR 可以解决你的问题的，你可以试试
赞一下(1人) 回复此楼
Imaginationismoreimportantthanknowledge！
20楼2013-11-09 02:09:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 chrisluxal 的主题更新
232/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料学调剂 +7 提神豆沙包 2026-02-28 9/450 2026-03-01 11:50 by 王伟要上岸啊
[考研] 290求调剂 +7 材料专硕调剂； 2026-02-28 8/400 2026-03-01 11:45 by 王伟要上岸啊
[考研] 材料类求调剂 +8 wana_kiko 2026-02-28 8/400 2026-03-01 11:44 by 王伟要上岸啊
[考研] 材料284求调剂，一志愿郑州大学英一数二 +7 想上岸的土拨鼠 2026-02-28 7/350 2026-03-01 11:44 by 月下best
[考研] 求调剂 +5 repeatt?t 2026-02-28 5/250 2026-03-01 11:43 by 王伟要上岸啊
[考研] 311求调剂 +9 南迦720 2026-02-28 10/500 2026-03-01 10:55 by sunny81
[考研] 291分工科求调剂 +7 science饿饿 2026-03-01 8/400 2026-03-01 10:43 by sunny81
[硕博家园] 2025届双非化工硕士毕业，申博 +3 更多的是 2026-02-27 4/200 2026-03-01 10:04 by ztg729
[论文投稿] 求助coordination chemistry reviews 的写作模板 10+3 ljplijiapeng 2026-02-27 4/200 2026-03-01 09:07 by babero
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 292求调剂 +3 yhk_819 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:57 by gaoxiaoniuma
[考研] 295求调剂 +5 19171856320 2026-02-28 5/250 2026-02-28 21:39 by gaoxiaoniuma
[考博] 26申博 +4 想申博！ 2026-02-26 4/200 2026-02-28 21:37 by limorning
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
[考研] 276求调剂 +3 路lyh123 2026-02-28 4/200 2026-02-28 19:45 by 路lyh123
[考研] 0856材料求调剂 +10 hyf hyf hyf 2026-02-28 11/550 2026-02-28 18:50 by 无际的草原
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +4 礼堂丁真258 2026-02-28 6/300 2026-02-28 16:18 by 求调剂zz
[基金申请] 面上可以超过30页吧？ +12 阿拉贡aragon 2026-02-22 13/650 2026-02-26 22:09 by Hahaxia
[硕博家园] 【博士招生】太原理工大学2026化工博士 +4 N1ce_try 2026-02-24 8/400 2026-02-26 08:40 by N1ce_try
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭