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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法
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kehan777

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 22:37:26
另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！...


保护性碱基+酶切位点+24bp+引物序列（15），可不止39bp哦，这么长的引物序列，P起来有难度，成功的话，就把电泳图发出来给我们借鉴啊，加油！！
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11楼2013-11-08 23:16:24
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
chrisluxal: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:04:34
引用回帖:
9楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 21:59:37
我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样 ...

15bp延长至20bp也没有问题，大胆的做吧，没问题的
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
12楼2013-11-08 23:23:14
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by kehan777 at 2013-11-08 23:16:24

保护性碱基+酶切位点+24bp+引物序列（15），可不止39bp哦，这么长的引物序列，P起来有难度，成功的话，就把电泳图发出来给我们借鉴啊，加油！！...

39bp是指除了酶切位点和保护碱基以外的序列 呵呵 不好意思哈 没说清楚
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人生来自由
13楼2013-11-09 00:08:54
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-08 23:23:14
15bp延长至20bp也没有问题，大胆的做吧，没问题的...

刚给老板讲完 看看是否同意我这么做！非常感谢！
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人生来自由
14楼2013-11-09 00:10:38
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happy1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 21:59:37
我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样 ...

目的片段应该不用这么长吧，可能10左右就差不多了，但是具体的话得实验做了才知道啊，因为酶切位点啥的都不能改，所以只能试试看。你可以调整下保护碱基，看看会不会好点。
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穿越黑暗必是阳光普照
15楼2013-11-09 00:44:05
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happy1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 22:37:26
另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！...

加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物pcr，估计可能也有50bp左右，应该可以回收，酶切后跟那个长片段连接，可能这样更好些。
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穿越黑暗必是阳光普照
16楼2013-11-09 00:52:55
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
觉得引物太长就分两次PCR，一次加12个碱基在你的引物上，第二次再加十二个碱基和酶切位点
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17楼2013-11-09 00:56:56
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-09 00:52:55
加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物 ...

我也觉得这样应该会更好些，不过我的确是想要这两个连在一起，我再考虑一下！非常感谢！
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人生来自由
18楼2013-11-09 01:40:23
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chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-09 00:56:56
觉得引物太长就分两次PCR，一次加12个碱基在你的引物上，第二次再加十二个碱基和酶切位点

不好意思  有点不太明白你的意思，能不能再具体一点呢？谢谢！
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人生来自由
19楼2013-11-09 01:50:53
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plantvirus

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
overlap PCR 可以解决你的问题的，你可以试试
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Imaginationismoreimportantthanknowledge！
20楼2013-11-09 02:09:18
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