应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两短片段连接并插入EGFP载体的解决方法
232/3返回列表上一页123下一页
查看: 2284  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

kehan777

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 22:37:26
另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！...


保护性碱基+酶切位点+24bp+引物序列（15），可不止39bp哦，这么长的引物序列，P起来有难度，成功的话，就把电泳图发出来给我们借鉴啊，加油！！
赞一下 回复此楼
11楼2013-11-08 23:16:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
chrisluxal: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-11-09 07:04:34
引用回帖:
9楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 21:59:37
我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样 ...

15bp延长至20bp也没有问题，大胆的做吧，没问题的
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
12楼2013-11-08 23:23:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by kehan777 at 2013-11-08 23:16:24

保护性碱基+酶切位点+24bp+引物序列（15），可不止39bp哦，这么长的引物序列，P起来有难度，成功的话，就把电泳图发出来给我们借鉴啊，加油！！...

39bp是指除了酶切位点和保护碱基以外的序列 呵呵 不好意思哈 没说清楚
赞一下 回复此楼
人生来自由
13楼2013-11-09 00:08:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-08 23:23:14
15bp延长至20bp也没有问题，大胆的做吧，没问题的...

刚给老板讲完 看看是否同意我这么做！非常感谢！
赞一下 回复此楼
人生来自由
14楼2013-11-09 00:10:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 21:59:37
我的意思是把这24bp直接作为引物的一部分另外连接目的片段的一部分对吧？我试了一下 我的引物结构是这样的：保护碱基+酶切位点+24bp+15bp目的基因片段，我试了只有连接15bp才能够扩出目的片段，短了就不行了，这样 ...

目的片段应该不用这么长吧，可能10左右就差不多了，但是具体的话得实验做了才知道啊，因为酶切位点啥的都不能改，所以只能试试看。你可以调整下保护碱基，看看会不会好点。
赞一下 回复此楼
穿越黑暗必是阳光普照
15楼2013-11-09 00:44:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy1985

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by chrisluxal at 2013-11-08 22:37:26
另外再追问一个问题，我是不是需要在24bp和150bp的序列间加一个linker？以保证他们能够表达不受影响？谢谢！！...

加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物pcr，估计可能也有50bp左右，应该可以回收，酶切后跟那个长片段连接，可能这样更好些。
赞一下 回复此楼
穿越黑暗必是阳光普照
16楼2013-11-09 00:52:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sun_in_night

木虫 (小有名气)
觉得引物太长就分两次PCR，一次加12个碱基在你的引物上，第二次再加十二个碱基和酶切位点
赞一下 回复此楼
17楼2013-11-09 00:56:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by happy1985 at 2013-11-09 00:52:55
加linker会好点，我以为你只是想把它直接连起来呢。
现在这样的话你可以把linker放在短片段的那边，看看能不能把保护碱基+酶切位点+24bp+linker+酶切位点这么多设计成两个有部分重叠的引物，到时直接拿这两个引物 ...

我也觉得这样应该会更好些，不过我的确是想要这两个连在一起，我再考虑一下！非常感谢！
赞一下 回复此楼
人生来自由
18楼2013-11-09 01:40:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chrisluxal

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-09 00:56:56
觉得引物太长就分两次PCR，一次加12个碱基在你的引物上，第二次再加十二个碱基和酶切位点

不好意思  有点不太明白你的意思，能不能再具体一点呢？谢谢！
赞一下 回复此楼
人生来自由
19楼2013-11-09 01:50:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

plantvirus

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
overlap PCR 可以解决你的问题的，你可以试试
赞一下(1人) 回复此楼
Imaginationismoreimportantthanknowledge！
20楼2013-11-09 02:09:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 chrisluxal 的主题更新
232/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 提交了我也来说说感想 +8 fummck 2026-05-20 9/450 2026-05-21 11:41 by maxjing
[论文投稿] 投稿求助，期刊 +3 希冀，有书读 2026-05-20 4/200 2026-05-21 11:07 by 希冀，有书读
[基金申请] 评审有感 +15 popular289 2026-05-18 26/1300 2026-05-21 10:35 by 西葫芦炒鸡蛋
[基金申请] 今年审到国自然15份，谈谈感受 +21 国自然国社科中 2026-05-17 22/1100 2026-05-21 09:37 by 2000zf36392
[论文投稿] Sci. Bull. 悲剧经验 +7 jyang1999 2026-05-16 8/400 2026-05-21 08:50 by 能丫
[论文投稿] 投MDPI的三个期刊都被桌拒 +3 木虫研究牲 2026-05-17 4/200 2026-05-21 08:02 by bobvan
[文学芳草园] 献血感触 +7 呀呀好傻 2026-05-19 12/600 2026-05-21 07:08 by maolC
[考博] 云南大学材料与能源学院解琳课题组钙钛矿博士招生 +4 光伏爱好者 2026-05-17 6/300 2026-05-21 01:37 by 17520222914
[基金申请] 国自然评分 +3 无名者登山 2026-05-20 4/200 2026-05-20 13:29 by vito刘
[考博] 如果工作了想读博，可以边工作边读全日制嘛？ 30+3 铁达火车 2026-05-18 5/250 2026-05-20 09:33 by tfang
[有机交流] 如何实现卤原子转化 +3 BT20230424 2026-05-15 8/400 2026-05-20 09:32 by xtlilibin
[教师之家] 上海大学实验技术岗位非升即走 +12 嘻嘻哈哈乐呵呵 2026-05-15 13/650 2026-05-20 08:34 by xli1984
[基金申请] 2026山东省优青 +3 luckinging 2026-05-14 4/200 2026-05-19 16:15 by 52wls
[考博] 找博士生导师 +6 小代想上岸 2026-05-15 7/350 2026-05-19 10:22 by free_fisher
[考博] 26/27申博自荐-锂/钠电池方向 5+3 狗头军师. 2026-05-15 4/200 2026-05-19 09:10 by moonboat
[基金申请] 同样的基金本子，换个专家直接从C变A！ (金币-10) +3 国自然国社科中 2026-05-19 3/150 2026-05-19 08:50 by Equinoxhua
[考博] 2026博士还有哪些学校有名额 +7 小王求读研 2026-05-15 8/400 2026-05-19 08:27 by zhyzzh
[考博] 博士申请 +5 星…… 2026-05-18 6/300 2026-05-18 23:49 by 糊糊涂涂好
[基金申请] 国自然上会要求 +5 无名者登山 2026-05-18 9/450 2026-05-18 17:50 by BlakeReary
[硕博家园] 申请博士 +3 呃?呃 2026-05-15 3/150 2026-05-16 11:01 by a4742549
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭