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邓满凤

新虫 (初入文坛)

[求助] 急需

有哪位大侠做过磁性纳米颗粒固定化漆酶？为什么我将0.1- 0.25%的戊二醛直接加入到1ml0.5mol/ml的漆酶溶液（包含了5mg的氨基化的二氧化硅）中，在冰箱中固定化12个小时后测酶活回收率怎么只有3%？可以帮忙分析下吗
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1楼 2013-10-29 08:56:52
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duruo

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孩儿她爹

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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markar: 金币+1, 感谢回帖交流！ 2013-11-01 15:40:31
邓满凤(红舟流星代发): 金币+2, 代扣代发金币 2014-03-25 10:52:12
0.5mol/mL ？ 笔误吧？
不知道你的操作过程如何

不过将戊二醛直接加入酶的溶液中，应该会造成酶自身的交联，使其失活

先用戊二醛活化二氧化硅，然后加入酶，可能会好些
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能攻心则反侧自消，从古知兵非好战；不审势即宽严皆误，后来治蜀要深思
2楼2013-10-29 14:35:21
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邓满凤

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by duruo at 2013-10-29 14:35:21
0.5mol/mL ？ 笔误吧？
不知道你的操作过程如何

不过将戊二醛直接加入酶的溶液中，应该会造成酶自身的交联，使其失活

先用戊二醛活化二氧化硅，然后加入酶，可能会好些

请问0.5mg/ml的酶液不行吗？我试过先用戊二醛活化二氧化硅，然后加入酶，但活性收率太低了
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3楼2013-10-29 15:15:56
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duruo

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【答案】应助回帖

★
邓满凤(红舟流星代发): 金币+1, 代扣代发金币 2014-03-25 10:52:19
引用回帖:
3楼: Originally posted by 邓满凤 at 2013-10-29 15:15:56
请问0.5mg/ml的酶液不行吗？我试过先用戊二醛活化二氧化硅，然后加入酶，但活性收率太低了...

呵呵，0.5mg可以，0.5mol就太大了

你是怎么计算活性收率的？最好把整个过程都写出来
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4楼2013-10-29 15:21:35
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邓满凤

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by duruo at 2013-10-29 15:21:35
呵呵，0.5mg可以，0.5mol就太大了

你是怎么计算活性收率的？最好把整个过程都写出来...

取6mg氨基活化的磁性二氧化硅纳米颗粒分散到1ml浓度为0.5mg/ml漆酶溶液（用磷酸盐缓冲液配置）中，加入20ul，0.1%的戊二醛，然后将反应混合物置于4℃的恒温摇床上反应13h，其中摇床的转速为150rpm。反应结束时，用磁铁吸住磁性微球，倾去上清液。用磷酸盐缓冲液（0.1M，PH 7）洗涤磁性纳米颗粒，并且记录好每次洗涤的体积，直到上清液检测不到蛋白质为止。将所制备的固定化漆酶保存在磷酸盐缓冲液中。

活性收率=固定上的酶活力/相同量的游离酶的活力
固定化酶的活力是在线测5min ,得到吸光值与时间的关系，算出活力
以前用先交联喜干净后再加酶进行固定化，条件跟上面说的一样，为什么这两种方法测出来的活性收率这么低？真心希望得到你的指导，谢谢！
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5楼2013-10-31 18:50:45
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duruo

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邓满凤(markar代发): 金币+2, 感谢回帖交流！ 2013-11-01 15:40:51
引用回帖:
5楼: Originally posted by 邓满凤 at 2013-10-31 18:50:45
取6mg氨基活化的磁性二氧化硅纳米颗粒分散到1ml浓度为0.5mg/ml漆酶溶液（用磷酸盐缓冲液配置）中，加入20ul，0.1%的戊二醛，然后将反应混合物置于4℃的恒温摇床上反应13h，其中摇床的转速为150rpm。反应结束时，用 ...

现在看有几个可能：
1、固载酶含量测定有误差，尤其是固载量很低的情况下，误差就会更大；
2、戊二醛本身对酶活性有影响，这里主要是指酶被戊二醛交联，因此导致的活性降低；
3、酶在固定化后，其最佳催化条件可能与游离态不同（比如温度）。

解决方法：
1、提高酶固载量，建议你在偏酸条件下进行反应，有利于希夫碱的形成；
2、在不加磁性纳米粒的情况下，看看戊二醛与酶反应后酶的活力，排除戊二醛交联的影响；
3、优化固定化酶活力检测条件
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能攻心则反侧自消，从古知兵非好战；不审势即宽严皆误，后来治蜀要深思
6楼2013-11-01 11:13:56
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邓满凤

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by duruo at 2013-11-01 11:13:56
现在看有几个可能：
1、固载酶含量测定有误差，尤其是固载量很低的情况下，误差就会更大；
2、戊二醛本身对酶活性有影响，这里主要是指酶被戊二醛交联，因此导致的活性降低；
3、酶在固定化后，其最佳催化条件可 ...

听了你的建议后收获很大，我想问下，测定漆酶活力的温度文献上都在25度，pH4.5 左右，如果我要改变测活的温度是提高温度好还是升温好些，或者PH偏酸性好些呢？如果用环氧基对二氧化硅表面进行修饰是不是可以避免戊二醛的使用从而提高活性？但是环氧基与酶上面的氨基基团容易反应吗？反应条件怎么样?
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7楼2013-11-01 13:56:46
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