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lb3522922

铜虫 (小有名气)

[求助] 二次PCR

最近再做PCR,第一次的产物不特异,切胶回收后浓度有30ng/μL左右,然后以此为模板进行第二次PCR,具体做法是取1微升模板,引物与前次PCR相同,但是产物跑电泳却没有条带,只有引物二聚体附近的小条带。增加模板的量也不行,不知道问题出在什么地方了。请各位给分析分析。不胜感激。
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cicisnow

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


gyesang: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-29 01:38:23
你用什么酶扩增的,有些酶对模板要求很高的
2楼2013-10-28 21:00:23
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lb3522922

铜虫 (小有名气)

3楼2013-10-29 10:18:25
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素手就琴

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你说你第一次的产物不特异,那要带marker ,确定你切胶回收的是你需要的那个条带,别切错了。你增加模板,引物二聚体有没有很亮?
人生多烦忧,不如一吊解千愁~
4楼2013-10-29 11:59:24
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

应该是切胶回收后的缓冲液对Taq酶有影响!!
5楼2013-10-29 12:00:14
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的终极目的是要做什么,为什么要做二次PCR是要留图吗
may
6楼2013-10-29 12:52:35
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lb3522922

铜虫 (小有名气)

增加模板也没作用,引物二聚体挺亮的。切胶回收后是用水洗脱的,应该没有其他缓冲液了。我做二次PCR的目的是想做基因克隆,第一次PCR后回收的量少,无法进行下面的实验。
7楼2013-10-29 13:58:42
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-29 23:54:26
楼主,这个问题曾经困扰我了很久。
我的经验是二次PCR 效果都不是太好,如果需要改进的话我有两个办法:
1.就是设计巢式PCR引物,这样效果会好点;
2.就是把你的片段连到载体里,克隆扩增,酶切也可以;或者用质粒为模板也可以。

建议你不要在这方面浪费太多的时间,尽快跳过这一步,重新设计引物 ,或者连载体都不会花很多时间的
8楼2013-10-29 21:48:58
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