24小时热门版块排行榜    

查看: 1234  |  回复: 7

lb3522922

铜虫 (小有名气)

[求助] 二次PCR

最近再做PCR,第一次的产物不特异,切胶回收后浓度有30ng/μL左右,然后以此为模板进行第二次PCR,具体做法是取1微升模板,引物与前次PCR相同,但是产物跑电泳却没有条带,只有引物二聚体附近的小条带。增加模板的量也不行,不知道问题出在什么地方了。请各位给分析分析。不胜感激。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicisnow

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


gyesang: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-29 01:38:23
你用什么酶扩增的,有些酶对模板要求很高的
2楼2013-10-28 21:00:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lb3522922

铜虫 (小有名气)

3楼2013-10-29 10:18:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

素手就琴

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你说你第一次的产物不特异,那要带marker ,确定你切胶回收的是你需要的那个条带,别切错了。你增加模板,引物二聚体有没有很亮?
人生多烦忧,不如一吊解千愁~
4楼2013-10-29 11:59:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

应该是切胶回收后的缓冲液对Taq酶有影响!!
5楼2013-10-29 12:00:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的终极目的是要做什么,为什么要做二次PCR是要留图吗
may
6楼2013-10-29 12:52:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lb3522922

铜虫 (小有名气)

增加模板也没作用,引物二聚体挺亮的。切胶回收后是用水洗脱的,应该没有其他缓冲液了。我做二次PCR的目的是想做基因克隆,第一次PCR后回收的量少,无法进行下面的实验。
7楼2013-10-29 13:58:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-29 23:54:26
楼主,这个问题曾经困扰我了很久。
我的经验是二次PCR 效果都不是太好,如果需要改进的话我有两个办法:
1.就是设计巢式PCR引物,这样效果会好点;
2.就是把你的片段连到载体里,克隆扩增,酶切也可以;或者用质粒为模板也可以。

建议你不要在这方面浪费太多的时间,尽快跳过这一步,重新设计引物 ,或者连载体都不会花很多时间的
8楼2013-10-29 21:48:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lb3522922 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 271材料工程求调剂 +6 .6lL 2026-03-18 6/300 2026-03-19 15:41 by haoshis
[考研] 294求调剂材料与化工专硕 +11 陌の森林 2026-03-18 11/550 2026-03-19 13:22 by houyaoxu
[考研] 一志愿南昌大学,327分,材料与化工085600 +3 Ncdx123456 2026-03-19 3/150 2026-03-19 13:18 by houyaoxu
[考研] 287求调剂 +3 晨昏线与星海 2026-03-19 4/200 2026-03-19 12:32 by peike
[考研] 一志愿吉林大学材料学硕321求调剂 +6 Ymlll 2026-03-18 9/450 2026-03-19 10:28 by 星空星月
[考研] 0703化学 305求调剂 +4 FY_yy 2026-03-14 4/200 2026-03-19 05:54 by anny19840123
[考研] 311求调剂 +11 冬十三 2026-03-15 12/600 2026-03-18 14:36 by 星空星月
[考研] 302求调剂 +10 呼呼呼。。。。 2026-03-17 10/500 2026-03-18 12:45 by Linda Hu
[考研] 考研求调剂 +3 橘颂. 2026-03-17 4/200 2026-03-17 21:43 by 有只狸奴
[考研] 296求调剂 +5 大口吃饭 身体健 2026-03-13 5/250 2026-03-17 21:05 by 不惑可乐
[考研] 332求调剂 +6 Zz版 2026-03-13 6/300 2026-03-17 17:03 by ruiyingmiao
[考研] 0854控制工程 359求调剂 可跨专业 +3 626776879 2026-03-14 9/450 2026-03-16 17:42 by 626776879
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
[考研] 326求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-15 3/150 2026-03-16 07:33 by Iveryant
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化,一志愿:哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy! 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 学硕285求调剂 +13 Wisjxn 2026-03-12 46/2300 2026-03-14 10:33 by JourneyLucky
[考研] [0860]321分求调剂,ab区皆可 +4 宝贵热 2026-03-13 4/200 2026-03-13 22:01 by 星空星月
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
信息提示
请填处理意见