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lb3522922

铜虫 (小有名气)

[求助] 二次PCR

最近再做PCR，第一次的产物不特异，切胶回收后浓度有30ng/μL左右，然后以此为模板进行第二次PCR，具体做法是取1微升模板，引物与前次PCR相同，但是产物跑电泳却没有条带，只有引物二聚体附近的小条带。增加模板的量也不行，不知道问题出在什么地方了。请各位给分析分析。不胜感激。
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1楼 2013-10-22 14:14:05
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cicisnow

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-29 01:38:23
你用什么酶扩增的，有些酶对模板要求很高的
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2楼2013-10-28 21:00:23
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lb3522922

铜虫 (小有名气)
Ex Taq
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3楼2013-10-29 10:18:25
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素手就琴

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你说你第一次的产物不特异，那要带marker ，确定你切胶回收的是你需要的那个条带，别切错了。你增加模板，引物二聚体有没有很亮？
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人生多烦忧，不如一吊解千愁~
4楼2013-10-29 11:59:24
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

应该是切胶回收后的缓冲液对Taq酶有影响！！
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5楼2013-10-29 12:00:14
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710002191

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的终极目的是要做什么，为什么要做二次PCR是要留图吗
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may
6楼2013-10-29 12:52:35
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lb3522922

铜虫 (小有名气)
增加模板也没作用，引物二聚体挺亮的。切胶回收后是用水洗脱的，应该没有其他缓冲液了。我做二次PCR的目的是想做基因克隆，第一次PCR后回收的量少，无法进行下面的实验。
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7楼2013-10-29 13:58:42
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 23:54:26
楼主，这个问题曾经困扰我了很久。
我的经验是二次PCR 效果都不是太好，如果需要改进的话我有两个办法：
1.就是设计巢式PCR引物，这样效果会好点；
2.就是把你的片段连到载体里，克隆扩增，酶切也可以；或者用质粒为模板也可以。

建议你不要在这方面浪费太多的时间，尽快跳过这一步，重新设计引物 ，或者连载体都不会花很多时间的
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8楼2013-10-29 21:48:58
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