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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 生工测序重叠峰交流
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

[交流] 生工测序重叠峰交流

我在做表达载体（表达一段小rna全长138bp），构建后的载体热击入top10，单菌落挑出来（但是菌落太密集，可能会不小心把两个菌落增到一个区域。）。
经过筛菌，提质粒双酶切和pcr验证条带成功。然后送测序，结果生工返回的结果：

原文：“7号，19号 （使用引物  PBV220R） 测序后发现有重叠现象”，然后给了我用PBAD-F_J引物测序的结果。上blast之后结果是一个载体序列。


百思不得其解。

1：如果是重叠峰。怎么还给了一个结果。
2：如果我酶切验证的条带都出来了。怎么测序还会是空的呢。

目前自我分析结果：1可能长出来的单菌落比较密集。筛菌时候混杂了带有空载体的菌。2但是这样的话。为什么还给了结果呢？3生工靠谱吗？怎么解决呢。是不是我吧增的菌再画个4区然后再增下验证再测序呢？

求有测序经验的朋友帮忙分析解释下吧!谢谢
生工测序重叠峰交流
测序7号19号.png

[ Last edited by 沙门小rna on 2013-10-14 at 17:35 ]
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    • 2013-10-14 17:23:37, 343.15 K

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1楼 2013-10-14 17:33:00
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lyz65956

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-10-15 13:57:30
沙门小rna: 金币+2, 我会告诉你我的序列太短了我直接blast显示的是载体吗？其实人家测序早就给我结果了。我tm真笨。只要直接把我的小rna序列和结果比对就好了。今天跟老板讨论被骂了~ 2013-10-16 02:09:21
在生工测序，最近的结果一会告诉我是双峰，一会说没信号，一会又测出来了，但是图谱不好。
其他的都正常，让我也百思不得其解。
后来办法是，把测序不正常的重新划钱分离，挑选单克隆，再送测序
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5楼2013-10-15 12:32:22
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沙门小rna

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 沙门小rna at 2013-10-15 10:28:08

终于有一个回复的，怎么连人都没有啊。我可是诚心交流讨教的。家里25块金币给了10个
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4楼2013-10-15 10:29:25
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taccycle

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
沙门小rna: 金币+1 2013-10-17 02:14:43
沙门小rna: 金币+1, 已经测序好了。我sb了。序列结果blast出来发现是质粒的匹配。因为我的序列138bp，被淹没在茫茫数据库中了。1000多的测序结果中那一点点的匹配被比了下去。 2013-10-17 17:09:33
你可以自己做PCR扩增包含出入片段的区域，然后电泳，如果获得了目的片段，就把目的片段给生工测序，如果PCR都有问题的话那就有问题了
赞一下 回复此楼
6楼2013-10-16 17:07:38
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xfyangsibs

银虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
沙门小rna: 金币+1, 不是的，谢谢 2013-10-18 16:55:49
可能是结构比较复杂，难测，建议换一条反向引物试试。
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7楼2013-10-17 12:27:18
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沙门小rna3楼
2013-10-15 10:28   回复  
引用回帖:
2楼: Originally posted by yingying1588 at 2013-10-14 22:14:00

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