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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » HeLa细胞传代后90% 死亡，求解
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挫人小鱼

新虫 (小有名气)

[求助] HeLa细胞传代后90% 死亡，求解

本人菜鸟，才开始学养细胞。

替别人传 细胞，结果HeLa细胞状态好，长的太快，本是第二天下午传的，结果没时间，第三天中午传的。因为细胞长的很满，不过也有很多死细胞，就一个大瓶传了一个中瓶，两个大瓶。镜检，三个瓶子中细胞浓度很大。根据以前的经验，长一天绝对很满。结果第四天早上，也就是今天早晨看的时候，90%的细胞飘起来了，只有10%细胞贴壁生长，而且状态不好。
这次的培养基是新配的，初步认为可能是新配置的培养基没有混合均匀，因为我加入FBS和双抗之后，只是左右晃动几下培养基，10min之后开始用这个培养基（配置培养基后才开始消化细胞），不知道是不是这个原因。
双抗是找别人借的，人家说浓度是100 X 的。DMEM是新的，FBS是用过的，冰箱放置了约3天吧。

其次是前天传了一批自己养的HeLa细胞，培养基是以前的，昨天看还是可以的，死细胞不多，只是贴壁细胞不多，但是今天早上看的时候，也是很多死细胞，状态不好，不知道什么原因。

不知道是不是污染导致这些细胞离我而去？求大侠们解答。
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1楼 2013-09-29 12:12:45
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回帖置顶 ( 共有2个 )

梦幻未碎

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 20:25:27
gyesang: 回帖置顶 2013-09-29 20:25:32
挫人小鱼: 金币+3 2013-10-07 17:46:48
亲！细胞消化只要肉眼可见培养瓶底部细胞脱落就可以加培养基进行轻柔吹打，一般消化在1~2min，具体以观察为准。消化8分钟居然还能有10％活细胞真的是奇迹了。。。。
培养液里面有没有脏脏的感觉？
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开阔
4楼2013-09-29 17:01:58
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 17:29:21
gyesang: 回帖置顶 2013-09-30 17:29:23
挫人小鱼: 金币+3 2013-10-07 17:45:56
挫人小鱼: 金币+4 2013-10-07 17:46:56
传代后状态不好或者死的一般就四个原因：1.接触细胞的液体温度过低2.胰酶浓度过高或者消化时间过长3.吹打分散时力度过大或吹打时间过长4.细胞污染。你的DMEM培养基从4℃冰箱拿出来之后有没有经过温箱复温？一般在换液或者传达之前要把培养基、PBS、胰酶放进37℃温箱复温30min左右。细胞状态本来很好的话接触凉的培养基一般都会变的很差，状态不好的细胞接触凉的培养基一般都会挂掉。由于没说你胰酶使用浓度，所以不好判断是不是消化过头，或者吹打分散细胞时太大力。细胞污染很容易判断，传代后培养基变浑浊，或者颜色变黄或者镜检能看到很多小黑点就是污染了。
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6楼2013-09-30 14:09:30
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普通回帖

arystal

金虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-29 20:25:18
会不会是胰酶消化的时间过久了；或者是吹散成单细胞悬液的时候，力道过大了，影响到细胞状态了？
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2楼2013-09-29 13:46:27
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挫人小鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by arystal at 2013-09-29 13:46:27
会不会是胰酶消化的时间过久了；或者是吹散成单细胞悬液的时候，力道过大了，影响到细胞状态了？

胰酶消化时间是8min，有些细胞漂浮起来了才停止消化；我以为是细胞长老了，所以消化时间较久。
吹打细胞貌似是一直这么吹的，以前的还好。

听实验室师妹说可能是FBS不够，导致细胞饿死了。不知道是不是。
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3楼2013-09-29 16:22:30
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liangdouxion

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
消化8min，细胞绝对不会死的，我觉得是你细胞张的太慢了，要注意及时换液与传代，传的时候可以传的稀一些，hela长得很快。
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毛球
5楼2013-09-30 09:17:36
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挫人小鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liangdouxion at 2013-09-30 09:17:36
消化8min，细胞绝对不会死的，我觉得是你细胞张的太慢了，要注意及时换液与传代，传的时候可以传的稀一些，hela长得很快。

谢谢，我有重新消化，更换了培养基，细胞长得很大只，就是死细胞很多，有抱团现象。不过贴壁细胞状态比不换液前要好。
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7楼2013-09-30 19:00:27
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
Hela细胞，长得快，但是非常矫情的一个细胞系。别的细胞系不换培养液都是一个个的死，及时补换培养液还是有救的。Hela细胞要死那就是商量好了，一瓶一瓶的死，一个不拉的去见马克思。
高糖培养液基本不会饿死细胞系，除了变成非常黄的时候。
觉得可能还是消化、重悬的哪一个步骤出了问题。
采用含EDTA的胰酶消化效果会好很多，海拉细胞消化的话基本是一粒一粒的，不像其他的细胞会一团一团的下来（但是一团一团消化下来的细胞贴壁、生长的可能会更快）。
Hela细胞个人觉得不适合新手练手的，因为这细胞非常矫情。很容易一个不留的死光光。觉得hela细胞优势就是长得快，缺点就是非常容易死光光（别的细胞系都是一个一个的死，这货真是一瓶一瓶的死）。
养细胞不要怕，多练几次就好，Hela细胞养死了就不要花心思拯救，直接换一批新的Hela细胞就好
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8楼2013-09-30 22:37:27
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超然渡陈

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦幻未碎 at 2013-09-29 17:01:58
亲！细胞消化只要肉眼可见培养瓶底部细胞脱落就可以加培养基进行轻柔吹打，一般消化在1~2min，具体以观察为准。消化8分钟居然还能有10％活细胞真的是奇迹了。。。。
培养液里面有没有脏脏的感觉？

你说消化8min还有10％活细胞真的是奇迹了，估计是你养的细胞种类比较少吧。不同细胞对胰酶耐受区别很大的。有很多肿瘤细胞或者原代细胞贴壁性很强，状态好的情况下0.25%的胰酶37℃温箱消化七八分钟也未必能充分分离。
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9楼2013-10-01 22:51:43
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挫人小鱼

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 梦幻未碎 at 2013-09-29 17:01:58
亲！细胞消化只要肉眼可见培养瓶底部细胞脱落就可以加培养基进行轻柔吹打，一般消化在1~2min，具体以观察为准。消化8分钟居然还能有10％活细胞真的是奇迹了。。。。
培养液里面有没有脏脏的感觉？

不好意思，国庆回家。
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10楼2013-10-07 15:00:15
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