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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 扩内含子
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后悔无期

金虫 (小有名气)

[求助] 扩内含子

有完整的CDS区大约1000bp，想要扩内含子，分三段，分两段都试过，设计了好多对引物就是扩不出条带！巣式PCR也做了，扩出来的条带不是想要的！ 在数据库中也找不到其他物种该基因的DNA序列！ 我该如何是好，请大侠们指点！多谢
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别回忆，因为回不去。把眼泪留给最疼你的人，把微笑留给伤你最深的人。
1楼 2013-09-21 21:05:56
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-29 10:15:07
后悔无期: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-10-12 11:22:41
gyesang: 回帖置顶 2013-10-12 12:20:59
1.内含子存在于基因组DNA中，因此必须以基因组DNA为模板扩增。
2.在cDNA的5‘端和3’端设计一对引物，争取1次就将包含内含子的基因序列扩增出来。
3.尝试一下不同的退火和延伸时间，因为你并不知道你的基因的序列长度。
4.如果用fermentas的超保真酶扩增的话，延伸时间设定依据是：2kb/min

仅供参考。
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4楼2013-09-29 08:46:45
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普通回帖

王希望

铁杆木虫 (正式写手)
换个生物公司的酶试试
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2楼2013-09-24 16:07:12
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sj082csh

银虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-13 18:09:16
1.研究对象是动物吗？多组合几对引物跑跑看，会不会正好引物之间没有内含子？ 2.跑gDNA的时候，另外也需用cDNA跑跑看，做个对照哈。

[ 发自小木虫客户端 ]
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

后悔无期
3楼2013-09-29 08:00:13
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后悔无期

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by sj082csh at 2013-09-29 08:00:13
1.研究对象是动物吗？多组合几对引物跑跑看，会不会正好引物之间没有内含子？ 2.跑gDNA的时候，另外也需用cDNA跑跑看，做个对照哈。

是植物，分三段，扩出来片段了！
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别回忆，因为回不去。把眼泪留给最疼你的人，把微笑留给伤你最深的人。
5楼2013-10-12 11:25:19
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后悔无期

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lixg at 2013-09-29 08:46:45
1.内含子存在于基因组DNA中，因此必须以基因组DNA为模板扩增。
2.在cDNA的5‘端和3’端设计一对引物，争取1次就将包含内含子的基因序列扩增出来。
3.尝试一下不同的退火和延伸时间，因为你并不知道你的基因的序列 ...

有个问题想请教你，  之前扩目的条带扩出来了，现在条件相同却扩不出来，或者扩出来目的条带很弱，新换了试剂，新合成了引物，优化模板和引物 还是不行，现在不知道怎么做了！
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别回忆，因为回不去。把眼泪留给最疼你的人，把微笑留给伤你最深的人。
6楼2013-10-16 09:50:45
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 后悔无期 at 2013-10-16 09:50:45
有个问题想请教你，  之前扩目的条带扩出来了，现在条件相同却扩不出来，或者扩出来目的条带很弱，新换了试剂，新合成了引物，优化模板和引物 还是不行，现在不知道怎么做了！...

嗯，如果条带很弱的话，可将产物回收，依次作为模板，再扩一次试试。
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7楼2013-10-17 09:05:51
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yangsusu123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lixg at 2013-10-17 09:05:51
嗯，如果条带很弱的话，可将产物回收，依次作为模板，再扩一次试试。...

您好！我就是用你的这种方法，我进行胶回收，做模板，再扩竟然就没有了，这是为什么呢？
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8楼2013-11-26 10:35:53
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yangsusu123

新虫 (初入文坛)
楼主，现在我也要扩一段基因，只知道它的cDNA序列，从这上面设计引物，然后要扩增，想问一下你，从基因组上扩增内含子有啥实验心得可以分享一下吗，感激不尽！！！
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9楼2013-11-26 10:37:57
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sunbeam_s

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 后悔无期 at 2013-10-12 11:25:19
是植物，分三段，扩出来片段了！...

你好，我也扩出来，但是不知道怎么比对，新生，求赐教
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10楼2015-08-05 10:47:04
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