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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 植保 » 土壤磷酸酶活性测定遇到问题急需求解？？
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小沐虫

金虫 (初入文坛)

[求助] 土壤磷酸酶活性测定遇到问题急需求解？？

最近在测酸性磷酸酶，先做表曲，发现没有梯度变化，都显示一个颜色，不知道为什么？？
我的方法是取0、1、2、3、4、5、6和7mL酚的工作液置于50mL容量瓶中，分别加入20mLddH20,再加入0.25mL缓冲液pH5.O的醋酸盐缓冲0.5mL2%的4-氨基安替啦琳溶液，0.5rnL8%的铁氰化钾溶液。每次加入试剂都要充分摇动，最后定容至50mL，15min后，并在分光光度计波长为570nm比色。绘制标准曲线。
  求解？？？？？？？？？？？？？？？
  测土样里磷酸酶发现颜色是深蓝色，最终不是粉红色吗？并且各处理测的值也相近。很郁闷，找不出原因？？？求高手指点！！！！！！！！
   我的方法如下：
称取5g过20目蹄的风干土样，置于50rnL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min
后，加l0mL憐酸苯二钠溶液和l0mL相应的缓冲液（酸性憐酸酶：pH5.0的醋酸盐
缓冲液），充分振荡摇勻后置于37T：恒温箱培养24h。过滤，取3mL滤液加入50mL容量瓶中，加 20mLddH20，加0.25mL缓冲液（酸性憐酸酶：pH5.0的醋酸盐缓冲液），0.5mL2%的4-氨基安替批琳溶液，0.5mL8%的铁氰化钾溶液15min后，在分光光度计波长为570nm比色测定溶液的吸光度值.                                                               
      急求解答·······························  非常感谢！
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1楼 2013-09-19 15:46:30
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a2004054

金虫 (知名作家)

快乐家族-安

优秀版主
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小沐虫 at 2013-09-24 20:07:12
谢谢 ！那想请问下你最终反应后的颜色还是粉红色吗？我是在加入反应液后是玫瑰红色，再反应15分钟后就变成浅黄色了~~...

对了，显色剂最好避光保存，现用现配
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随遇而安
7楼2013-09-26 11:16:27
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a2004054

金虫 (知名作家)

快乐家族-安

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小沐虫: 金币+20, ★有帮助 2013-09-24 20:07:30
4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：
1、试剂配制
（1）甲苯
（2）磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚）
（3）缓冲液
（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液
缓冲溶液配制：
(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)
A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。
B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL
醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB混合即得
（2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0）
硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：
A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中
B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中
50mLA＋43mLB加水稀释至200mL，混匀即得
（3）硼酸盐缓冲液（pH9.0）
A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中
B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中
硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得
（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）
A：0.1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸. H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL蒸馏水中
B：0.2M磷酸氢二钠：35.61g磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g磷酸氢二钠.7 H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12 H2O）溶于1000mL蒸馏水中
柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混匀即得
（5）2.5％铁氰化钾
（6）0.5％的4－氨基安替吡啉溶液
（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。
（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）
2、操作步骤：
    称取5ｇ土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。再加入5mL磷酸苯二钠（6.75g溶于1L水）和5mL相应的缓冲液(酸性磷酸酶用pＨ5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液)，同时对每一土样都设置用5mL水代替基质的对照。仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24ｈ。
用热至38℃的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上)，再用致密滤纸过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mL pＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL 2.5％的铁氰化钾和3mL 0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。
磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。
标准曲线：分别向100mL容量瓶中注入1，3， 5，7，9，11mL工作液并显色定容（分别相当于0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg酚），待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。


这是我用的方法，一直用都没有问题
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随遇而安
2楼2013-09-24 14:35:36
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zenghuizhou

银虫 (小有名气)
是啊 我也是用上述方法测的没有问题啊
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药不医假病，酒不解真愁
3楼2013-09-24 18:08:36
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小沐虫

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a2004054 at 2013-09-24 09:35:36
4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：
1、试剂配制
（1）甲苯
（2）磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚）
（3）缓冲液
（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液
缓冲溶液配制 ...

谢谢 ！那想请问下你最终反应后的颜色还是粉红色吗？我是在加入反应液后是玫瑰红色，再反应15分钟后就变成浅黄色了~~
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4楼2013-09-24 20:07:12
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