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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 质谱分析 » 质谱分析蛋白质溶剂比例
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yinjuanchen

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 质谱分析蛋白质溶剂比例

Q1：如题，用质谱分析蛋白质，ESI源，在保证蛋白质不变性的前提下，有经验的前辈推荐下溶剂甲醇和水的比例。（我用1:1的比例，发生的严重的变性，只用水作溶剂，由于仪器本身的限制，电离电压最大为5500V，不能电离）
Q2:通过质谱图的电荷分布，为何可以知道溶液中蛋白质存在几种构象？（构象不同，所带电荷不同，但怎么区分不同的构象，谱图有什么特征？）
谢谢！

[ 来自小组 Ocean家族 ]
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闭关，写写写
1楼2013-09-05 21:02:58
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chenzhengyi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yinjuanchen: 金币+1, ★有帮助, 谢谢！ 2013-09-06 19:50:29
你要加点甲酸，0.1%就可以了。你选的是正离子模式吧，还有你最好把仪器的类型说明清楚。至于用MS做蛋白质构象分析，我感觉不可能；你查阅相关文献了？你的蛋白分析是自上而下方法还是鸟枪法；一般而言蛋白分析是先酶解再分析的吧（自上而下，= =;有点混淆，反正就是有直接分析和酶解后再分析）
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有阳光的地方就会有阴影
2楼2013-09-06 11:39:43
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yinjuanchen

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenzhengyi at 2013-09-06 11:39:43
你要加点甲酸，0.1%就可以了。你选的是正离子模式吧，还有你最好把仪器的类型说明清楚。至于用MS做蛋白质构象分析，我感觉不可能；你查阅相关文献了？你的蛋白分析是自上而下方法还是鸟枪法；一般而言蛋白分析是先酶 ...

谢谢你的回复！样品里面有缓冲溶液，所以没加酸。你的意思是不用加有机溶剂了吗？酶解，蛋白质就成多肽了，我要看蛋白质不是分析蛋白质结构。
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闭关，写写写
3楼2013-09-06 19:48:22
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wx_55

铜虫 (小有名气)
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4楼2013-09-06 22:14:35
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organicsuper

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

蛋白质，多肽作质谱的溶剂一般是水跟乙腈，再加0.1%的三氟乙酸。至于乙腈的用量跟样品的极性有关。样品电离后是否带多电荷是跟溶液的酸性有关，但是酸度过高会导致蛋白质析出。这个合适的溶剂要自己慢慢摸索。
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5楼2013-09-25 09:37:23
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lzjessie_wlf

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
yinjuanchen: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2013-09-26 08:08:40
引用回帖:
3楼: Originally posted by yinjuanchen at 2013-09-06 19:48:22
谢谢你的回复！样品里面有缓冲溶液，所以没加酸。你的意思是不用加有机溶剂了吗？酶解，蛋白质就成多肽了，我要看蛋白质不是分析蛋白质结构。...

蛋白不变性指的是intact protein  的表征吗？一般0.1%的酸就变性了吧。
  如果只是想知道分子量，那么将样品变性，除盐，在良溶剂中(水，ACN, MeOH) 加0.1%的酸所使用的样品量并不比直接带buffer检测所用量多。
  如果要在buffer中，保持蛋白不变性的化，要求质谱能够检测到蛋白的话，一般来说蛋白的浓度要和buffer的浓度相当（即蛋白的浓度不小于buffer浓度的十倍). 同时使用buffer的浓度最大不超过10mM，优先使用可以气化的buffer （比如NH4HCO3, NH4Ac). 再其次的buffer是tris buffer。
  
    如果蛋白溶在钠盐，钾盐之类的buffer中，可以通过透析交换buffer.
   
   表面活性剂对蛋白的检测干扰也非常大。如果buffer中含有表面活性剂，要通过超滤膜(比如分子量截留1000， 3000，5000，10，000)等等，除掉不相干的小分子。
   
    搜aldrich, millipore蛋白纯化产品，可以看到一系列的蛋白质除盐，缓冲液交换，样品浓缩，超滤膜等等相关的产品。

    实在不行，可以将样品送到蛋白质组学分析检测中心，附带蛋白纯化要求。
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6楼2013-09-25 10:44:27
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lzjessie_wlf

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
yinjuanchen: 金币+1, ★有帮助, 谢谢！ 2013-09-26 08:08:58
Q2
简单来说，蛋白的构象越团簇，或者说缩成一团，那么它暴露在外面的可被质子化的个数 或者说戴电荷的个数会越少。
   越紧缩的构象，所带电荷越少，那么蛋白在m/z较大区域的分布信号就会越强。
   质谱图上，蛋白相关的多电荷峰会往m/z大的区域偏移。

加强酸denature后，m/z信号往小的区域偏移。

同一溶液中，蛋白同时存在几种构象，并且具体如何区分这几种构象，我就不太清楚了。
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7楼2013-09-25 11:03:53
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yinjuanchen

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lzjessie_wlf at 2013-09-25 10:44:27
蛋白不变性指的是intact protein  的表征吗？一般0.1%的酸就变性了吧。
  如果只是想知道分子量，那么将样品变性，除盐，在良溶剂中(水，ACN, MeOH) 加0.1%的酸所使用的样品量并不比直接带buffer检测所用量多。
...

你好！非常感谢你对帖子的关注和热心回复。需测试的蛋白样品，是外来样，他们所需要的就是在没有其它外在影响因素诱导蛋白质变性的基础上，通过所获得的质谱图的电荷分布，观察加配体前后蛋白质的构象变化。
  最初的样品盐含量很高，已透析除盐。关于醋酸或醋酸铵及有机溶剂的相对量，我们都正在实验中（因实验条件的原因，目前纯水，为获得质谱图。）。
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闭关，写写写
8楼2013-09-26 08:18:35
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yinjuanchen

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lzjessie_wlf at 2013-09-25 11:03:53
Q2
简单来说，蛋白的构象越团簇，或者说缩成一团，那么它暴露在外面的可被质子化的个数 或者说戴电荷的个数会越少。
   越紧缩的构象，所带电荷越少，那么蛋白在m/z较大区域的分布信号就会越强。
   质谱图上， ...

加配体前后，蛋白质的构象发生变化，电荷分布会有所不同的。
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闭关，写写写
9楼2013-09-26 08:20:09
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