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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 求助拟南芥SALK突变体纯合体鉴定中的问题
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zb0806030

银虫 (小有名气)

[求助] 求助拟南芥SALK突变体纯合体鉴定中的问题

我在鉴定SALK突变体纯合体过程中，发现以野生型的DNA为模板用LBb1+RP引物进行PCR的时候也能扩出同T-DNA插入突变体中相大小的条带，请教哪位高手给分析一下，为什么会这样，怎么解决此类问题？
    附件中的图为其中一次得结果，我分别用了三次提的Col DNA，结果都是一样的，请教高手解答，谢谢！
求助拟南芥SALK突变体纯合体鉴定中的问题
2013.8.28.jpg
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厚积薄发
1楼 2013-08-28 21:34:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by implicitly at 2014-12-16 09:31:26
同问

你可以上这个网站http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html，在搜索框中输入你的T-DNA号，如salk_012345，搜索以后直接会给出LP 和RP的引物，这个引物网站设计好的，你检测T-DNA条带不管插入方向如何，只需要用RP+LBb1扩就可以了，一般网站设计的基因条带大小都为1000左右，T-DNA条带肯定小于基因条带。网站的LB不需要反向互补，可以直接可以用。
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厚积薄发
11楼2014-12-16 20:17:02
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微笑莫凝汐

新虫 (初入文坛)
楼主 请问一下  你是如何查到RP+LBb1扩出条带的大小的呢？还有 你是怎么知道LBb1是离LP近还是离RP近啊？也就是说我现在不懂如何设计T-DNA上的引物 不知道用哪个  也不知道它离LP和RP有多少距离。网上找到的LB引物的序列是直接就可以拿来用吗？还是要反向互补序列呢？这个与T-DNA插入的方向是不是有关系呢？我是新手 楼主如果明白请给我讲解一下好吗？不胜感激！
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8楼2013-10-29 17:06:34
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普通回帖

十比

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zb0806030: 金币+2, ★有帮助 2013-08-31 10:46:52
个人觉得是污染，PCR太灵敏，从图看明显可能是野生型的样品条带明显弱。
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2楼2013-08-30 08:34:33
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 十比 at 2013-08-30 08:34:33
个人觉得是污染，PCR太灵敏，从图看明显可能是野生型的样品条带明显弱。

谢谢你的回复，我再做PCR的时候做一个对照吧，看看是不是引物污染了，再次感谢！
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厚积薄发
3楼2013-08-31 09:08:12
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小杰4444

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你这个明显不是LB1+RP的条带大小啊，不是目的条带！改变退火温度再试试吧。
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4楼2013-09-01 08:48:23
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小杰4444 at 2013-09-01 08:48:23
你这个明显不是LB1+RP的条带大小啊，不是目的条带！改变退火温度再试试吧。

我这个确实是目的条带的大小，它的差入位置比较靠后，我查了它RP+LBb1扩出条带的大小，谢啦！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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厚积薄发
5楼2013-09-01 22:40:32
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科技广场

铜虫 (小有名气)
你好，你的LBb1+rp条带多大？
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6楼2013-09-03 16:18:14
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 科技广场 at 2013-09-03 16:18:14
你好，你的LBb1+rp条带多大？

从marker的位置看是位于250到500bp的条带之间，我的marker是takara的250bp marker，最亮的一条带是1000，下面依次是750、500、250、100.可能由于我截图的原因，250bp的条带看的不是很清楚。
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厚积薄发
7楼2013-09-03 19:55:10
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implicitly

新虫 (初入文坛)
同问
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9楼2014-12-16 09:31:26
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 微笑莫凝汐 at 2013-10-29 17:06:34
楼主 请问一下  你是如何查到RP+LBb1扩出条带的大小的呢？还有 你是怎么知道LBb1是离LP近还是离RP近啊？也就是说我现在不懂如何设计T-DNA上的引物 不知道用哪个  也不知道它离LP和RP有多少距离。网上找到的LB引物的 ...

你可以上这个网站http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html，在搜索框中输入你的T-DNA号，如salk_012345，搜索以后直接会给出LP 和RP的引物，这个引物网站设计好的，你检测T-DNA条带不管插入方向如何，只需要用RP+LBb1扩就可以了，一般网站设计的基因条带大小都为1000左右，T-DNA条带肯定小于基因条带。网站的LB不需要反向互补，可以直接可以用。
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厚积薄发
10楼2014-12-16 20:15:33
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