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红宝石sky

新虫 (初入文坛)


[交流] 经液氮研磨处理后蛋白质失活

我利用家蚕蛹表达重组蛋白,发病蚕蛹经液氮研磨后,离心上清中检测到目的蛋白,但是没有活性,而蚕蛹匀浆、冻干后检测是有活性的,是不是液氮的极低温度使蛋白质失活?但是理论上蛋白质低温下活性受到抑制,不会失活,温度恢复后活性应该也会恢复吧?实验重复了几次都是这样,现在我也搞不清楚了,还请各位高手指点一下!
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Sthunder

木虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2013-08-08 08:17:47
红宝石sky: 金币+1 2013-08-13 17:36:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by 红宝石sky at 2013-08-07 10:03:39
谢谢!我也觉的不太可能,但是结果就是不一样,活性差一点也说的过去,可是居然没有活性,可能是我的蛋白太矫情了?还有一点是,两种情况下蛋白没有定量,可能浓度不同,但是我估算着浓度不会差太多,而且我测活性是 ...

你液氮,研磨后离心是什么速度下进行的?你蚕蛹匀浆冻干是离心后上清冻干,还是没有离心?有可能是离心的时候,蛋白被离下去了。建议做个液氮研磨粉末活性测定,同时蚕蛹匀浆在相同条件下离心后上清活性测定!
4楼2013-08-07 21:45:15
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Sthunder

木虫 (正式写手)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
红宝石sky: 金币+1 2013-08-07 10:04:05
一般情况下是不会出现这种问题的,但也不是不可能,因为用液氮处理一次,就相当于速冻融一次。
2楼2013-08-06 22:23:24
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红宝石sky

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-06 22:23:24
一般情况下是不会出现这种问题的,但也不是不可能,因为用液氮处理一次,就相当于速冻融一次。

谢谢!我也觉的不太可能,但是结果就是不一样,活性差一点也说的过去,可是居然没有活性,可能是我的蛋白太矫情了?还有一点是,两种情况下蛋白没有定量,可能浓度不同,但是我估算着浓度不会差太多,而且我测活性是定性不需要定量,所以觉得没必要,看来要考虑这个因素了,现在正在用不同浓度的冻干粉测活。
3楼2013-08-07 10:03:39
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红宝石sky

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-07 21:45:15
你液氮,研磨后离心是什么速度下进行的?你蚕蛹匀浆冻干是离心后上清冻干,还是没有离心?有可能是离心的时候,蛋白被离下去了。建议做个液氮研磨粉末活性测定,同时蚕蛹匀浆在相同条件下离心后上清活性测定!...

不好意思,最近有点事不在实验室也没有及时回复sthunder,谢谢你的建议
我的操作是:匀浆后没有离心,全粉冻干,测活时用PBS重悬后15000rpm离心10min,两次 ,上清过膜后检测;液氮研磨后没有加PBS,4℃放置溶化后,15000rpm离心30min,两次上清过膜后检测。因为是做抑菌活性检测,所以需要过膜除菌。
我的蛋白是分泌性的,应该在上清吧,会被离下去吗??
5楼2013-08-13 17:36:04
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