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红宝石sky

新虫 (初入文坛)

[交流] 经液氮研磨处理后蛋白质失活

我利用家蚕蛹表达重组蛋白，发病蚕蛹经液氮研磨后，离心上清中检测到目的蛋白，但是没有活性，而蚕蛹匀浆、冻干后检测是有活性的，是不是液氮的极低温度使蛋白质失活？但是理论上蛋白质低温下活性受到抑制，不会失活，温度恢复后活性应该也会恢复吧？实验重复了几次都是这样，现在我也搞不清楚了，还请各位高手指点一下！
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1楼 2013-08-06 16:09:35
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Sthunder

木虫 (正式写手)
★ ★
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红宝石sky: 金币+1 2013-08-07 10:04:05
一般情况下是不会出现这种问题的，但也不是不可能，因为用液氮处理一次，就相当于速冻融一次。
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2楼2013-08-06 22:23:24
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红宝石sky

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-06 22:23:24
一般情况下是不会出现这种问题的，但也不是不可能，因为用液氮处理一次，就相当于速冻融一次。

谢谢！我也觉的不太可能，但是结果就是不一样，活性差一点也说的过去，可是居然没有活性，可能是我的蛋白太矫情了?还有一点是，两种情况下蛋白没有定量，可能浓度不同，但是我估算着浓度不会差太多，而且我测活性是定性不需要定量，所以觉得没必要，看来要考虑这个因素了，现在正在用不同浓度的冻干粉测活。
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3楼2013-08-07 10:03:39
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Sthunder

木虫 (正式写手)
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silicare: 金币+2, 谢谢参与 2013-08-08 08:17:47
红宝石sky: 金币+1 2013-08-13 17:36:39
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3楼: Originally posted by 红宝石sky at 2013-08-07 10:03:39
谢谢！我也觉的不太可能，但是结果就是不一样，活性差一点也说的过去，可是居然没有活性，可能是我的蛋白太矫情了?还有一点是，两种情况下蛋白没有定量，可能浓度不同，但是我估算着浓度不会差太多，而且我测活性是 ...

你液氮，研磨后离心是什么速度下进行的？你蚕蛹匀浆冻干是离心后上清冻干，还是没有离心？有可能是离心的时候，蛋白被离下去了。建议做个液氮研磨粉末活性测定，同时蚕蛹匀浆在相同条件下离心后上清活性测定！
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4楼2013-08-07 21:45:15
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红宝石sky

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-07 21:45:15
你液氮，研磨后离心是什么速度下进行的？你蚕蛹匀浆冻干是离心后上清冻干，还是没有离心？有可能是离心的时候，蛋白被离下去了。建议做个液氮研磨粉末活性测定，同时蚕蛹匀浆在相同条件下离心后上清活性测定！...

不好意思，最近有点事不在实验室也没有及时回复sthunder，谢谢你的建议。
我的操作是：匀浆后没有离心，全粉冻干，测活时用PBS重悬后15000rpm离心10min，两次 ，上清过膜后检测；液氮研磨后没有加PBS，4℃放置溶化后，15000rpm离心30min，两次上清过膜后检测。因为是做抑菌活性检测，所以需要过膜除菌。
我的蛋白是分泌性的，应该在上清吧，会被离下去吗？？
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5楼2013-08-13 17:36:04
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Sthunder

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 红宝石sky at 2013-08-13 17:36:04
不好意思，最近有点事不在实验室也没有及时回复sthunder，谢谢你的建议。
我的操作是：匀浆后没有离心，全粉冻干，测活时用PBS重悬后15000rpm离心10min，两次 ，上清过膜后检测；液氮研磨后没有加PBS，4℃放 ...

下次液氮也离心10 min吧，估计是离心的原因。我以前做胞外酶的时候也是由于离心速度过大，时间过长，导致没有酶活，后来降低速度就OK了。Good luck！
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6楼2013-08-13 22:52:41
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红宝石sky

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-13 22:52:41
下次液氮也离心10 min吧，估计是离心的原因。我以前做胞外酶的时候也是由于离心速度过大，时间过长，导致没有酶活，后来降低速度就OK了。Good luck！...

非常感谢你的建议！
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7楼2013-08-14 13:11:56
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