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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 杯具的求助，关于蛋白质分离纯化，出峰太早，各种凝胶柱都试过就是分不开~~
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稚涵晓晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 杯具的求助，关于蛋白质分离纯化，出峰太早，各种凝胶柱都试过就是分不开~~

本人想要分离一种蛋白质，用Native-PAGE电泳跑过8%的分离胶，分子量在200KDa附近，可是用Sephacryl s-200和Sephacryl s-300均尝试过，悲剧的是出峰都好早，第8管就出峰了，并且只有一个峰，也就是说根本没分离开，流速我都设定的是0.5ml/min，3ml/管，柱长是100cm，内径1.0cm的，这是怎么回事呀？？？
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1楼 2013-07-30 10:57:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果不是柱子的问题，应该是你的样品中主要成分集中在200kD。你可以先不用凝胶过滤，试试用其它柱子。
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2楼2013-07-30 11:09:02
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稚涵晓晓

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-30 11:09:02
如果不是柱子的问题，应该是你的样品中主要成分集中在200kD。你可以先不用凝胶过滤，试试用其它柱子。

跑电泳看的话是，我要的蛋白在200KDa，还有其他就是在100KDa左右了，我现在考虑一个是蛋白是不是在高浓度时聚合在一起了……如果要真是该怎么解决？加NaCl？
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3楼2013-07-30 11:17:25
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wrx1989

银虫 (初入文坛)
可以根据待分离蛋白的其它性质，选择其它的分离方法，如离子交换，疏水层析等，
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4楼2013-07-30 13:28:15
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Rick在路上

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的蛋白到底多大？听起来好像是根据跑胶的大小来判断的？
一方面可以了解一下蛋白的理论分子量，还可以再跑SDS-PAGE看看，变性和非变性条件的两张图有什么区别。
多用几种柱子组合起来纯度会提高很多。即便是superdex系列分子筛这种比较高分辨率的，分离效率也挺一般的，不差个几十kd一般难以完全分开。
再就是过柱时候可以加一些还原剂，可能效果会好。试试看。
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5楼2013-07-30 21:36:09
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