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稚涵晓晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 杯具的求助,关于蛋白质分离纯化,出峰太早,各种凝胶柱都试过就是分不开~~

本人想要分离一种蛋白质,用Native-PAGE电泳跑过8%的分离胶,分子量在200KDa附近,可是用Sephacryl s-200和Sephacryl s-300均尝试过,悲剧的是出峰都好早,第8管就出峰了,并且只有一个峰,也就是说根本没分离开,流速我都设定的是0.5ml/min,3ml/管,柱长是100cm,内径1.0cm的,这是怎么回事呀???
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果不是柱子的问题,应该是你的样品中主要成分集中在200kD。你可以先不用凝胶过滤,试试用其它柱子。
2楼2013-07-30 11:09:02
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稚涵晓晓

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-30 11:09:02
如果不是柱子的问题,应该是你的样品中主要成分集中在200kD。你可以先不用凝胶过滤,试试用其它柱子。

跑电泳看的话是,我要的蛋白在200KDa,还有其他就是在100KDa左右了,我现在考虑一个是蛋白是不是在高浓度时聚合在一起了……如果要真是该怎么解决?加NaCl?
3楼2013-07-30 11:17:25
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wrx1989

银虫 (初入文坛)

可以根据待分离蛋白的其它性质,选择其它的分离方法,如离子交换,疏水层析等,
4楼2013-07-30 13:28:15
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Rick在路上

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的蛋白到底多大?听起来好像是根据跑胶的大小来判断的?
一方面可以了解一下蛋白的理论分子量,还可以再跑SDS-PAGE看看,变性和非变性条件的两张图有什么区别。
多用几种柱子组合起来纯度会提高很多。即便是superdex系列分子筛这种比较高分辨率的,分离效率也挺一般的,不差个几十kd一般难以完全分开。
再就是过柱时候可以加一些还原剂,可能效果会好。试试看。
5楼2013-07-30 21:36:09
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