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新手 荧光定量模板 问题？ 切切！！
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首先：我的对照组：把第0,1 2 ，……40天RNA进行等量混合后得到RNA混合样品 CK:浓度是284.6。。。（每天取400ng等量混合） 其次：实验组：也是第0,1,2，……40天RNA样品混合后得到RNA混合样品CU：浓度是322.4。。。（也是每天取400ng等量混合） 但是由于反转录效率等一系列原因 造成最后 实验组和对照组反转录后cDNA浓度不一样。 问题就来了：那么我上荧光的时候需不需要把实验组和对照组的模板 即：加的CDNA量 必须一致吗？？比如 实验组模板cDNA加100ng，对照组也加模板cDNA 100ng。（如果不一样的话，那么本来实验组a基因表达微弱，但是加的模板比较多，所以检测出来就比对照组表达高） 不知道我的想法对不对呢？？？急急急 |
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【答案】应助回帖
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不是这个意思。做定量要让模板的量是一致的，如果模板量相差很多会直接影响到扩增效率。标准曲线线性好扩增效率接近1也是在一定范围内的。但是从RNA反转录来的cDNA不能直接定量，需要消化掉RNA并经过纯化才能定量，没有人这样去做的。cDNA样品不能直接定量原因我前面已经解释了。所以要用同样量的RNA做反转录，为了保证效率一致，需要比较的样品最好同时做反转录。用内参去消除样品之间的微量差别也就是1与0.9，0.8的差别，不是1与10的差别。 |
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