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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手 荧光定量模板 问题？ 切切！！
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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 新手 荧光定量模板 问题？ 切切！！

首先：我的对照组：把第0,1 2 ，……40天RNA进行等量混合后得到RNA混合样品 CK:浓度是284.6。。。（每天取400ng等量混合）
其次：实验组：也是第0,1,2，……40天RNA样品混合后得到RNA混合样品CU：浓度是322.4。。。（也是每天取400ng等量混合）
但是由于反转录效率等一系列原因 造成最后 实验组和对照组反转录后cDNA浓度不一样。
问题就来了：那么我上荧光的时候需不需要把实验组和对照组的模板 即：加的CDNA量 必须一致吗？？比如 实验组模板cDNA加100ng，对照组也加模板cDNA 100ng。（如果不一样的话，那么本来实验组a基因表达微弱，但是加的模板比较多，所以检测出来就比对照组表达高）  不知道我的想法对不对呢？？？急急急
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微生物小硕
1楼 2013-07-25 15:50:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
学术问题(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-26 08:58:32
反转录出来的cDNA样品的浓度根本不能定，因为有RNA和dNTP干扰。想比较的样品需要同时反转录，取相同量的RNA为模板。做绝对定量的话就只能靠这么做了，如果是相对定量，需要和内参比，就会消除因模板量稍有差异对结果的影响了。
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2楼2013-07-26 01:16:20
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 01:16:20
反转录出来的cDNA样品的浓度根本不能定，因为有RNA和dNTP干扰。想比较的样品需要同时反转录，取相同量的RNA为模板。做绝对定量的话就只能靠这么做了，如果是相对定量，需要和内参比，就会消除因模板量稍有差异对结果 ...

我做的是相对定量啊   也就是说  做相对定量就不需要再去把cDNA调的一致了，是吧？？
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微生物小硕
3楼2013-07-26 08:29:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
学术问题: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-26 11:09:17
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-26 11:22:54
引用回帖:
3楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-26 08:29:10
我做的是相对定量啊   也就是说  做相对定量就不需要再去把cDNA调的一致了，是吧？？...

不是这个意思。做定量要让模板的量是一致的，如果模板量相差很多会直接影响到扩增效率。标准曲线线性好扩增效率接近1也是在一定范围内的。但是从RNA反转录来的cDNA不能直接定量，需要消化掉RNA并经过纯化才能定量，没有人这样去做的。cDNA样品不能直接定量原因我前面已经解释了。所以要用同样量的RNA做反转录，为了保证效率一致，需要比较的样品最好同时做反转录。用内参去消除样品之间的微量差别也就是1与0.9，0.8的差别，不是1与10的差别。
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4楼2013-07-26 09:42:37
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 09:42:37
不是这个意思。做定量要让模板的量是一致的，如果模板量相差很多会直接影响到扩增效率。标准曲线线性好扩增效率接近1也是在一定范围内的。但是从RNA反转录来的cDNA不能直接定量，需要消化掉RNA并经过纯化才能定量， ...

我就是这个样子啊  是用相同量的RNA 做的反转录   出来后测得cDNA的OD    对照组是920左右  实验组是890左右   这差距大吗？ 我怎么做呢？十分感谢你！！！！
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微生物小硕
5楼2013-07-26 11:07:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-07-26 11:07:41
我就是这个样子啊  是用相同量的RNA 做的反转录   出来后测得cDNA的OD    对照组是920左右  实验组是890左右   这差距大吗？ 我怎么做呢？十分感谢你！！！！...

我已经说了，有RNA同时存在，你测的OD定量根本没有意义，而且反转录体系里面加了dNTP，在紫外有吸收。我已经强调过多次了，直接测cDNA的OD根本不与cDNA的量直接相关。你必须纯化样品才能测OD。没有人这样去做，我也建议你具体该怎么做了，你听不听是你自己的事情。
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6楼2013-07-26 15:12:20
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 15:12:20
我已经说了，有RNA同时存在，你测的OD定量根本没有意义，而且反转录体系里面加了dNTP，在紫外有吸收。我已经强调过多次了，直接测cDNA的OD根本不与cDNA的量直接相关。你必须纯化样品才能测OD。没有人这样去做，我也 ...

本人新手不是！！  那我在细细 分析分析你的话！！ 还是感谢啊
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微生物小硕
7楼2013-07-26 19:48:22
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