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飘洋2008

金虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

本人初次做分子生物学,想将一目的基因约500bp,构建到PBI121载体上,计划先将目标片段加上酶切位点后连接到T载体上,再经双酶切后连到PBI121载体上,连到T载体后才发现酶切位点设计有问题,我设的酶切位点是XbaI/SacI,T载体上也有XbaI/SacI酶切位点,没办法完整切下目标片段,现在我该怎么做?能不能讲目标片段胶回收后直接连到经双酶切后连到PBI121载体上?请哪位高手能指点迷津,本人将不胜感激!
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飘洋2008

金虫 (著名写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by ctt1984 at 2013-07-21 14:28:33
1,如果你是加了保护碱基,那么对PCR产物胶回收之后直接连接到同样酶切的载体上;
2.片段连接到T载体上之后过夜酶切,尽管你有重复酶切位点,你切得时间足够长,会把所有位点都切开的,只要胶回收和你目的片段一样长 ...

非常感谢您的指点,我只设计了酶切位点,没有加保护性碱基。
11楼2013-07-21 21:20:47
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
飘洋2008(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:49:01
为什么不直接连PBI121载体
2楼2013-07-19 19:28:04
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题不大,可以直接酶切后连到PBI121载体上
3楼2013-07-19 19:29:35
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飘洋2008

金虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 幽魂银龙 at 2013-07-19 19:29:35
问题不大,可以直接酶切后连到PBI121载体上

你是说把连接好T载体的质粒酶切还是将目标片段酶切了连到PBI121载体上,如果是前者,根本行不通,直接将连接T载体的质粒切成2半了,后者者话能连到PBI121载体上吗?我是初学者,请分步详细说明。
4楼2013-07-19 22:15:56
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