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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有关羰基还原酶酶活测定中的几个问题
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史前五百年

金虫 (正式写手)

[交流] 有关羰基还原酶酶活测定中的几个问题

小弟做的是NADPH依赖型羰基还原酶，该酶在还原底物的过程中消耗NADPH。文献中测酶活是在A340nm处读到1min内的吸光度的降低的数值。反应总体系为250ul，包括100mmol/L磷酸钾缓冲液PH6.0，底物终浓度1mmol，辅酶NADPH终浓度0.25mmol和适量酶液。具体反映为将缓冲液，底物和辅酶依次加入后30度保温2min，加入适量酶液后读取1min内的A340nm处的吸光值的下降。可是小弟在配置辅酶NADPH时出现了问题，先前是用100mmol/L磷酸钾缓冲液PH6.0配置的，第二天就没有吸光值了，查了相关帖子，说NADPH在磷酸钾缓冲液中不稳定，会氧化，有人说用Tris-HCL配置，可是反应体系是磷酸钾缓冲液PH6.0，不知会有影响么，还有NADPH缓冲液怎么保存，配置成母液么？急急急！
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1楼 2013-07-19 09:44:51
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maxiaoqiang

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
史前五百年: 金币+10 2013-07-22 09:21:50
我们实验室有人做的 一般缓冲液用tris-HCL 效果比钠盐与钾盐的缓冲液好一点 另外辅酶的话一般可以配成母液的 保存在-40度冰箱中 一般没问题的 不过注意用量最好不要长期保存 另外辅酶购买也要注意  有问题的更换厂家试试 因为好多公司的辅酶都是进口分装的 所以在这个过程可能会出现问题 如果不是反应体系的问题 就是辅酶本身的问题 保存不当或者厂家质量等其他原因 我们这边开反应出现过好多次问题 一般都在辅酶的原因
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史前五百年
2楼2013-07-21 18:18:16
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史前五百年

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by maxiaoqiang at 2013-07-21 18:18:16
我们实验室有人做的 一般缓冲液用tris-HCL 效果比钠盐与钾盐的缓冲液好一点 另外辅酶的话一般可以配成母液的 保存在-40度冰箱中 一般没问题的 不过注意用量最好不要长期保存 另外辅酶购买也要注意  有问题的更换厂家 ...

很感谢
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3楼2013-07-22 00:05:21
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wswsjz

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
史前五百年: 金币+2 2013-07-22 09:21:42
祝福，祝福，美好的未来在向你招手！！！
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4楼2013-07-22 00:47:12
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史前五百年

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wswsjz at 2013-07-22 00:47:12
祝福，祝福，美好的未来在向你招手！！！

谢谢啊
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5楼2013-07-22 09:21:14
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sky_鼬

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
史前五百年: 金币+2 2013-07-23 08:22:24
史前五百年: 金币+2 2013-07-26 13:16:51
我硕士阶段也是做羰基还原酶的。用无菌水溶解即可，母液配10 mM左右，在-20℃保存，可以多分装成若干小管，相当于每次用的量，使用时注意要放置于冰上~
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6楼2013-07-23 00:07:32
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史前五百年

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sky_鼬 at 2013-07-23 00:07:32
我硕士阶段也是做羰基还原酶的。用无菌水溶解即可，母液配10 mM左右，在-20℃保存，可以多分装成若干小管，相当于每次用的量，使用时注意要放置于冰上~

谢谢！
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7楼2013-07-23 08:23:12
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齐美凤87

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼上说用磷酸缓冲液配NADPH不稳定，我现在用的是Tris-Hcl缓冲液PH7.0和PH7.4都配制过，但是都不稳定
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8楼2013-07-29 11:33:37
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laoguai123

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我看有用NAOH配的，不知道靠不靠谱
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9楼2013-08-26 14:22:31
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史前五百年

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 齐美凤87 at 2013-07-29 11:33:37
楼上说用磷酸缓冲液配NADPH不稳定，我现在用的是Tris-Hcl缓冲液PH7.0和PH7.4都配制过，但是都不稳定

用PH8-9比较稳定。
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10楼2013-08-26 21:11:44
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