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有关羰基还原酶酶活测定中的几个问题
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| 小弟做的是NADPH依赖型羰基还原酶,该酶在还原底物的过程中消耗NADPH。文献中测酶活是在A340nm处读到1min内的吸光度的降低的数值。反应总体系为250ul,包括100mmol/L磷酸钾缓冲液PH6.0,底物终浓度1mmol,辅酶NADPH终浓度0.25mmol和适量酶液。具体反映为将缓冲液,底物和辅酶依次加入后30度保温2min,加入适量酶液后读取1min内的A340nm处的吸光值的下降。可是小弟在配置辅酶NADPH时出现了问题,先前是用100mmol/L磷酸钾缓冲液PH6.0配置的,第二天就没有吸光值了,查了相关帖子,说NADPH在磷酸钾缓冲液中不稳定,会氧化,有人说用Tris-HCL配置,可是反应体系是磷酸钾缓冲液PH6.0,不知会有影响么,还有NADPH缓冲液怎么保存,配置成母液么?急急急! |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
史前五百年: 金币+10 2013-07-22 09:21:50
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
史前五百年: 金币+10 2013-07-22 09:21:50
我们实验室有人做的 一般缓冲液用tris-HCL 效果比钠盐与钾盐的缓冲液好一点 另外辅酶的话一般可以配成母液的 保存在-40度冰箱中 一般没问题的 不过注意用量最好不要长期保存 另外辅酶购买也要注意 有问题的更换厂家试试 因为好多公司的辅酶都是进口分装的 所以在这个过程可能会出现问题 如果不是反应体系的问题 就是辅酶本身的问题 保存不当或者厂家质量等其他原因 我们这边开反应出现过好多次问题 一般都在辅酶的原因 |
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史前五百年
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