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wangnengqiang

金虫 (小有名气)

[求助] 羰基还原酶上DEAEsepharose柱后测酶活、比活力都明显降低,不知道什么原因

我现在在进行氧化还原酶的分离纯化,硫酸铵盐析后,上DEAEsepharose柱,收集样品测酶活,酶活、比活力都很低。我看了很多文献,经过DEAE柱层析后比活力提高,而我做的几次实验,都是出现比活力降低,且下降明显,有没有碰见我类型的情况,不知道什么原因,大家帮我分析下,谢谢!
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8638600

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有没有可能是NaOH冲洗过柱子之后柱子pH值没有平衡好就开始过柱子呢?
2楼2012-04-18 14:29:08
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wangnengqiang

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 8638600 at 2012-04-18 14:29:08:
有没有可能是NaOH冲洗过柱子之后柱子pH值没有平衡好就开始过柱子呢?

谢谢,pH值平衡好了的,是不是要在平衡液和洗脱液中加入保护剂,比如甘油等?
3楼2012-04-19 14:36:32
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8638600

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zhaohq1209: 金币+2, 鼓励一哈子 2012-04-19 15:53:59
是呀~10%甘油~1mM DTT或2mM 巯基乙醇~还有0.5mM EDTA~这是我加的东东~供你参考~
4楼2012-04-19 15:28:07
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wangnengqiang

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 8638600 at 2012-04-19 15:28:07:
是呀~10%甘油~1mM DTT或2mM 巯基乙醇~还有0.5mM EDTA~这是我加的东东~供你参考~

我加了甘油,昨天做了一次,发现我的目标蛋白在穿透峰和用平衡液洗脱的峰出现,而不是用NaCl洗脱出现的峰。
5楼2012-04-20 09:38:09
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8638600

木虫 (正式写手)

我也是新手……可能是根柱子结合能力不够强吧……还是等电点的问题?不过这也是好事啊~如果大部分杂蛋白吸附了~你的目的蛋白吸附不住不是一样能够达到纯化的效果?
6楼2012-04-20 13:24:15
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