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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 羰基还原酶上DEAEsepharose柱后测酶活、比活力都明显降低，不知道什么原因
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wangnengqiang

金虫 (小有名气)

[求助] 羰基还原酶上DEAEsepharose柱后测酶活、比活力都明显降低，不知道什么原因

我现在在进行氧化还原酶的分离纯化，硫酸铵盐析后，上DEAEsepharose柱，收集样品测酶活，酶活、比活力都很低。我看了很多文献，经过DEAE柱层析后比活力提高，而我做的几次实验，都是出现比活力降低，且下降明显，有没有碰见我类型的情况，不知道什么原因，大家帮我分析下，谢谢！
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1楼 2012-04-17 22:15:34
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8638600

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有没有可能是NaOH冲洗过柱子之后柱子pH值没有平衡好就开始过柱子呢？
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2楼2012-04-18 14:29:08
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wangnengqiang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 8638600 at 2012-04-18 14:29:08:
有没有可能是NaOH冲洗过柱子之后柱子pH值没有平衡好就开始过柱子呢？

谢谢，pH值平衡好了的，是不是要在平衡液和洗脱液中加入保护剂，比如甘油等？
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3楼2012-04-19 14:36:32
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8638600

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zhaohq1209: 金币+2, 鼓励一哈子 2012-04-19 15:53:59
是呀~10%甘油~1mM DTT或2mM 巯基乙醇~还有0.5mM EDTA~这是我加的东东~供你参考~
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4楼2012-04-19 15:28:07
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wangnengqiang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 8638600 at 2012-04-19 15:28:07:
是呀~10%甘油~1mM DTT或2mM 巯基乙醇~还有0.5mM EDTA~这是我加的东东~供你参考~

我加了甘油，昨天做了一次，发现我的目标蛋白在穿透峰和用平衡液洗脱的峰出现，而不是用NaCl洗脱出现的峰。
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5楼2012-04-20 09:38:09
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8638600

木虫 (正式写手)
我也是新手……可能是根柱子结合能力不够强吧……还是等电点的问题？不过这也是好事啊~如果大部分杂蛋白吸附了~你的目的蛋白吸附不住不是一样能够达到纯化的效果？
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6楼2012-04-20 13:24:15
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