[交流] 有关羰基还原酶酶活测定中的几个问题

小弟做的是NADPH依赖型羰基还原酶，该酶在还原底物的过程中消耗NADPH。文献中测酶活是在A340nm处读到1min内的吸光度的降低的数值。反应总体系为250ul，包括100mmol/L磷酸钾缓冲液PH6.0，底物终浓度1mmol，辅酶NADPH终浓度0.25mmol和适量酶液。具体反映为将缓冲液，底物和辅酶依次加入后30度保温2min，加入适量酶液后读取1min内的A340nm处的吸光值的下降。可是小弟在配置辅酶NADPH时出现了问题，先前是用100mmol/L磷酸钾缓冲液PH6.0配置的，第二天就没有吸光值了，查了相关帖子，说NADPH在磷酸钾缓冲液中不稳定，会氧化，有人说用Tris-HCL配置，可是反应体系是磷酸钾缓冲液PH6.0，不知会有影响么，还有NADPH缓冲液怎么保存，配置成母液么？急急急！

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1楼 2013-07-19 09:44:51

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sky_鼬

铜虫 (初入文坛)

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史前五百年: 金币+2 2013-07-23 08:22:24
史前五百年: 金币+2 2013-07-26 13:16:51

我硕士阶段也是做羰基还原酶的。用无菌水溶解即可，母液配10 mM左右，在-20℃保存，可以多分装成若干小管，相当于每次用的量，使用时注意要放置于冰上~

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6楼2013-07-23 00:07:32

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maxiaoqiang

木虫 (正式写手)

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史前五百年: 金币+10 2013-07-22 09:21:50

我们实验室有人做的一般缓冲液用tris-HCL 效果比钠盐与钾盐的缓冲液好一点另外辅酶的话一般可以配成母液的保存在-40度冰箱中一般没问题的不过注意用量最好不要长期保存另外辅酶购买也要注意有问题的更换厂家试试因为好多公司的辅酶都是进口分装的所以在这个过程可能会出现问题如果不是反应体系的问题就是辅酶本身的问题保存不当或者厂家质量等其他原因我们这边开反应出现过好多次问题一般都在辅酶的原因

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史前五百年

2楼2013-07-21 18:18:16

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史前五百年

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2楼: Originally posted by maxiaoqiang at 2013-07-21 18:18:16
我们实验室有人做的一般缓冲液用tris-HCL 效果比钠盐与钾盐的缓冲液好一点另外辅酶的话一般可以配成母液的保存在-40度冰箱中一般没问题的不过注意用量最好不要长期保存另外辅酶购买也要注意有问题的更换厂家 ...

很感谢

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3楼2013-07-22 00:05:21

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