应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 畜牧兽医 » 做过RED同源重组的大侠们请进！
171/2返回列表12下一页
查看: 1814  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yiren12689

新虫 (初入文坛)

[交流] 做过RED同源重组的大侠们请进！ 已有5人参与

做过RED同源重组的大侠们请进，PKD46拷贝数低，提出的量总是不高，怎么转也转不到我的目的菌迟缓爱德华菌里面去，我用的氯化钙法，也不知道是不是感受态的问题怎么办啊，做好长时间做不出来，不知道是什么问题啊？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-11 10:01:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zy_696969

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
木虫/panda: 金币+1, 鼓励交流，欢迎常来农林版 2014-03-06 15:26:04
1、试试电转化？
2、如果觉得感受态不好的话可以先做个阳性对照，或者直接买Takara之类公司的感受态。
3、我从其它实验室接过来的冻存是质粒pKD46保存在菌株BW25113中的。可以找下相关文献看有没有把pKD46转到你的那株菌里。
我最近也在吭哧吭哧地做RED同源重组，但是还没有实质进展，一起加油哇。↖(^ω^)↗
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-10-14 15:09:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zy_696969

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by yiren12689 at 2014-03-06 10:17:41
现在质粒是转进去了，但是在转同源片段线性DNA又转不进去了，你现在进展如何？有什么好方法...

跟你卡在同一个地方~
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2014-03-06 16:32:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

蝶影拂袖

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得是你的感受态的问题，我们转到BL21里面很成功的~
赞一下 回复此楼
3楼2014-02-27 17:12:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yiren12689

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-02-27 17:12:10
我觉得是你的感受态的问题，我们转到BL21里面很成功的~

现在质粒是转进去了，但是同源重组的线性DNA老是电转不进去
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-06 10:16:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yiren12689

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zy_696969 at 2013-10-14 15:09:01
1、试试电转化？
2、如果觉得感受态不好的话可以先做个阳性对照，或者直接买Takara之类公司的感受态。
3、我从其它实验室接过来的冻存是质粒pKD46保存在菌株BW25113中的。可以找下相关文献看有没有把pKD46转到你的 ...

现在质粒是转进去了，但是在转同源片段线性DNA又转不进去了，你现在进展如何？有什么好方法
赞一下 回复此楼
5楼2014-03-06 10:17:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蝶影拂袖

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
木虫/panda: 金币+1, 鼓励交流，欢迎常来农林版 2014-03-06 15:26:29
引用回帖:
4楼: Originally posted by yiren12689 at 2014-03-06 10:16:08
现在质粒是转进去了，但是同源重组的线性DNA老是电转不进去...

线性片段浓度太低了？而且，一般表达pKD46的感受态现做现用效果最好，因为它表达了重组酶，放久了活性也会受到影响
赞一下 回复此楼
6楼2014-03-06 14:30:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yiren12689

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zy_696969 at 2014-03-06 16:32:59
跟你卡在同一个地方~...

也是电转吗？你们有没有用自杀性质粒做敲除的？
赞一下 回复此楼
8楼2014-03-06 19:09:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zy_696969

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by yiren12689 at 2014-03-06 19:09:13
也是电转吗？你们有没有用自杀性质粒做敲除的？...

嗯，产同源重组酶的质粒是pKD46，线性打靶片段是以pKD3为模板的。
赞一下 回复此楼
9楼2014-03-07 13:15:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yiren12689

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 蝶影拂袖 at 2014-03-06 14:30:51
线性片段浓度太低了？而且，一般表达pKD46的感受态现做现用效果最好，因为它表达了重组酶，放久了活性也会受到影响...

电转的话，用甘油法做感受态，我感觉甘油法没有氯化钙法效果好？
感受态细胞和线性DNA大概多少比例关系？DNA浓度得达到多少？
电转仪参数是不是有要求？
赞一下 回复此楼
10楼2014-03-10 15:49:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yiren12689 的主题更新
171/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭